摘要
采集食源性疾病暴发事件相关样本共47份，提取样本DNA进行食源性致病菌及腹泻病毒核酸检测，同时按照常规细菌分离培养方法进行病原菌分离鉴定。应用微量肉汤稀释法对分离到的克罗诺杆菌菌株进行耐药性检测，同时提取所有菌株核酸进行全基因组测序（WGS）并进一步进行菌株的致病性预测和基于直系同源基因簇的多位点序列分析（cogMLST）。
从30份样本中检测出克罗诺杆菌核酸阳性，未检测到其他常见肠道致病菌及腹泻病毒核酸。共分离得到9株克罗诺杆菌菌株（BQ1~BQ9），其中患者肛拭子6份，供餐企业工作人员肛拭子2份、食品留样1份。9株菌株的耐药谱基本一致。PathogenFinder在线预测这9株菌株均大概率具有致病性。MLST分型结果显示9株克罗诺菌株分属5个ST型，其中BQ3、BQ4和BQ9为ST8型。cogMLST分析发现，从患者肛拭子中分离出的BQ3和从食品留样中分离出的BQ9在进化树上聚为1支，并且只有2个ST位点的差异，两者高度同源。
克罗诺杆菌（以前被称为阪崎肠杆菌）是一类重要的食源性条件致病菌，奶粉是该菌感染人类最主要的感染媒介之一，也有报道其在肉类、水、蔬菜等多种食品中被检出。大多数克罗诺杆菌感染发生于新生儿和婴儿，常引起新生儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和败血症，并可能留下神经系统后遗症，早产儿感染克罗诺杆菌的死亡率甚至高达25%~80
2023年9月南京市某学校发生了一起疑似食源性疾病暴发事件，共搜索到疑似病例96人，均为9月20日在校进食午餐后出现腹痛、腹泻、恶心、呕吐等症状之一的本校学生。根据流行病学调查和实验室检测结果，高度怀疑为克罗诺菌属引起的食源性疾病暴发。本研究所有采集的样本进行了致病因子核酸及致病菌分离鉴定，并对分离到的克罗诺杆菌菌株进行了抗生素敏感性、多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）分析，为追踪传染源致病因子提供更多实验室依
2023年9月21日南京市某学校发生一起疑似食源性疾病暴发事件，截至9月22日，共搜索到疑似病例96人。病例以腹泻（100%）、腹痛（94.8%）为主要症状，部分伴恶心（11.4%），少数出现呕吐（3.1%）等症状。临床症状普遍较轻，未出现住院或重症病例。患者发病前72 h无共同进餐史，但均于9月20日进食由某餐饮公司统一配送的午餐。经比对食谱及询问病例发现，96名疑似病例午餐均食用过美味水饺，其中90人（93.37%）食用过某品牌鸡翅根。供餐企业当日配送午餐的工作人员及厨师也进食了相同的食物。
流行病学调查后发现首发病例出现于9月20日15时，末次病例出现于9月21日14时，首末次病例发病间隔23 h，发病中位数时间为9月20日23时。流行病学曲线提示呈点源暴露。详见
图1 疑似病例发病时间分布（N=96）
Figure 1 Distribution of onset time for suspected cases (N=96)
共采集样本47份，其中学生病例肛拭子样本29份、供餐企业员工肛拭子样本10份；后厨加工区域物表涂抹样4份；20日供餐企业午餐留样3份，分别为咖喱土豆肉丁、美味水饺、某品牌鸡翅根；20日学校留样1份，包括美味水饺、某品牌鸡翅根、紫菜蛋汤（使用带盖分格餐盘混合存放）。
ABI 7500荧光PCR仪（美国Thermofisher）；MiSeq测序仪（美国Illumina）；Sensititre ARIS 2X微生物鉴定及药敏分析系统（美国Thermofisher）。
14种食源性致病菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）（包括金黄色葡萄球菌、沙门菌、副溶血性弧菌、克罗诺杆菌、蜡样芽胞杆菌、大肠埃希菌、霍乱弧菌、空肠弯曲菌、志贺菌、嗜水气单胞菌、大肠埃希菌O157、单核细胞增生李斯特菌、结肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌）（北京美正生物科技公司）；诺如病毒GⅠ/GⅡ核酸检测试剂盒（荧光PCR法）、轮状病毒A/B/C组核酸检测试剂盒（荧光PCR法）、札如病毒、星状病毒和肠道腺病毒核酸检测荧光PCR试剂盒（江苏硕世有限公司）；阪崎肠杆菌显色培养基、胰蛋白胨大豆琼脂TSA（北京陆桥有限公司）；CAMHB肉汤培养基、食源性革兰氏阴性菌药敏板（美国Thermofisher）；NEBNex
使用诺唯赞DNA提取试剂盒提取各类拭子及食品样本的核酸，使用14种食源性致病菌核酸检测试剂盒及5种病毒核酸检测试剂盒在ABI 7500实时荧光PCR仪上进行扩增，扩增条件按照试剂盒说明书设置。同时按照国家食品安全风险评估中心食源性疾病监测手册和食品安全国家标准系列建议的标准化分离方案，对所有样本进行常见食源性致病菌分离鉴定。克罗诺杆菌的分离鉴定参照GB 4789.40—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌（阪崎肠杆菌）检验
根据美国临床试验标准研究所（CLSI
将提取好的全基因组DNA样品用Covaris超声波破碎仪随机打断成长度约为350 bp的片段。处理后的DNA片段经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成且库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量使用Illumina MiSeq测序仪进行全基因组测序（WGS）。MLST分型分析参考克罗诺杆菌分型的管家基因atpD，fusA，glnS，gltB，gyrB，infB，pps。利用BioNumerics软件得到拼接好的序列，使用Center for Genomic Epidemiology在线分析平台（https：//www.genomicepidemiology.org/services）中MLST 2.0分析功能，即获得相应的等位基因、ST型等BLAST比对信息。
利用拼接好的序列，使用Center for Genomic Epidemiology在线分析平台（https：//www.genomicepidemiology.org/services）中PathogenFinder功能进行致病性预测分析。
根据BioNumerics软件上的Cronobacter数据库使用cogMLST分型方法对基因组多位点序列位点进行注释。分析参数Scaling factor为1，Tolerance为0，使用complete linkage聚类方法进行计算建树。进化树共由36株菌株组成，其中9株来源于此次疑似食源性疾病暴发事件，17株选取自NCBI数据库网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）国内外克罗诺杆菌的序列信息，6株来源于2023年南京市食品安全风险监测食品样本中分离出的菌株，4株来源于2016年南京市一起克罗诺杆菌引起的疑似食源性疾病暴发事件分离出的菌株。
从30份样品中检出克罗诺杆菌核酸阳性，其中学生病例肛拭子21份；供餐企业工作人员肛拭子6份，分别为厨师1人，配送餐员工5人；美味水饺盛锅表面涂抹样1份；食品留样2份，包括供餐企业某品牌鸡翅根留样1份和学校混合食品餐盒留样1份，且学校留样中的美味水饺和某品牌鸡翅根独立检测均检出克罗诺杆菌核酸阳性。克罗诺杆菌在阪崎显色培养基上为蓝绿色菌落，质控菌株大肠埃希氏菌ATCC25922为无色菌落。经分离培养，在9份样本中得到克罗诺杆菌菌株，其中学生病例肛拭子6份，分别将其命名为BQ1~BQ6；供餐企业工作人员肛拭子2份，分别为厨师1人及负责分发餐盒的配餐员1人，命名为BQ7和BQ8，以及供餐企业食品留样1份（某品牌鸡翅根）命名为BQ9。详见
| 分类 | 克罗诺杆菌核酸 | 克罗诺杆菌菌株 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 克罗诺杆菌菌株核酸检测份数 | 核酸检测阳性数 | 核酸检测阳性率/% | 克罗诺杆菌菌株检测份数 | 培养阳性份数 | 再培养复苏率/% | |
| 学生病例肛拭子 | 29 | 21 | 72.41 | 21 | 6 | 28.57 |
| 供餐企业工作人员肛拭子 | 10 | 6 | 60.00 | 6 | 2 | 33.33 |
| 厨师肛拭子 | 3 | 1 | 33.33 | 1 | 1 | 100.00 |
| 配送餐员工肛拭子 | 7 | 5 | 71.43 | 5 | 1 | 20.00 |
| 供餐企业食品留样 | 3 | 1 | 33.33 | 1 | 1 | 100.00 |
| 学校食品留样 | 1 | 1 | 100.00 | 1 | 0 | 0.00 |
| 加工环境 | 4 | 1 | 25.00 | 1 | 0 | 0.00 |
| 合计 | 47 | 30 | 63.83 | 30 | 9 | 30.00 |
9株克罗诺杆菌菌株对14种抗生素的敏感性和耐药性结果如
| 抗生素菌株 | BQ1 | BQ2 | BQ3 | BQ4 | BQ5 | BQ6 | BQ7 | BQ8 | BQ9 | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 最小抑菌浓度/(µg/mL) | AMP | ≤2(S) | ≤2(S) | 4(S) | ≤2(S) | ≤2(S) | ≤2(S) | ≤2(S) | ≤2(S) | 4(S) |
| AMS | ≤2(S) | ≤2(S) | 8(S) | 4(S) | 4(S) | 4(S) | ≤2(S) | 4(S) | 4(S) | |
| CFX | 8(S) | 4(S) | 16(I) | 4(S) | 4(S) | 4(S) | 4(S) | 4(S) | 8(S) | |
| CFZ | 4(I) | 4(I) | 4(I) | 4(I) | 8(R) | 4(I) | 4(I) | 4(I) | 4(I) | |
| CTX | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | |
| CAZ | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | |
| IPM | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | |
| GEN | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | |
| CT | ≤0.12(I) | 0.5(I) | ≤0.12(I) | ≤0.12(I) | ≤0.12(I) | ≤0.12(I) | ≤0.25(I) | ≤0.12(I) | ≤0.12(I) | |
| TET | ≤1(S) | ≤1(S) | 2(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | ≤1(S) | 2(S) | |
| NAL | ≤2(S) | ≤2(S) | 4(S) | ≤2(S) | ≤2(S) | ≤2(S) | ≤2(S) | ≤2(S) | 4(S) | |
| CIP | ≤0.03(S) | ≤0.03(S) | ≤0.03(S) | ≤0.03(S) | ≤0.03(S) | ≤0.03(S) | ≤0.03(S) | ≤0.03(S) | ≤0.03(S) | |
| CHL | 4(S) | 8(S) | 16(S) | 8(S) | 8(S) | 8(S) | 4(S) | 4(S) | 8(S) | |
| SXT | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | ≤0.25(S) | |
| 耐药谱 | 菌株数 | 占比/% |
|---|---|---|
| CFZ | 1 | 11.10% |
全基因组测序下机数据在BN软件上进行组装。组装好的基因组序列上传至国家微生物科学数据中心NMDC平台（http：//nmdc.cn/）的生物项目数据库以获得核苷酸序列原始数据接受号。现已获得项目编号SUB1710469527263，菌株BQ1~BQ9对应的序列号为NMDC40052752~NMDC40052760。经全基因组序列比
PathogenFinder 1.
| Key | 是人类病原体的概率/% | 输入蛋白质组覆盖率/% | 匹配致病家族 | 匹配非致病家族 |
|---|---|---|---|---|
| BQ1 | 0.764 | 3.12 | 100 | 25 |
| BQ2 | 0.762 | 3.02 | 98 | 24 |
| BQ3 | 0.794 | 3.54 | 117 | 24 |
| BQ4 | 0.830 | 3.60 | 126 | 19 |
| BQ5 | 0.820 | 3.50 | 128 | 19 |
| BQ6 | 0.814 | 3.43 | 119 | 19 |
| BQ7 | 0.830 | 3.23 | 117 | 16 |
| BQ8 | 0.823 | 3.49 | 128 | 19 |
| BQ9 | 0.792 | 3.47 | 114 | 24 |
如
图2 克罗诺杆菌cogMLST进化树
Figure 2 cogMLST evolutionary tree of Cronobacter spp.
对本次疑似食源性疾病暴发事件中所采集样本的检测结果显示，可疑食品某品牌鸡翅根、病例学生、配餐员及厨师的肛拭子中均检出克罗诺杆菌。药敏试验结果显示分离出的9株克罗诺杆菌的耐药谱几乎完全一致。PathogenFinder预测发现这9株菌株均大概率具有致病性，其中与之相关联的8位病例均有腹泻、腹痛、呕吐等急性肠胃炎症状。对全基因组测序结果使用cogMLST分析发现，尽管本次实验鉴定出了两种不同的克罗诺杆菌，但分离自病例肛拭子的BQ3和分离自食品某品牌鸡翅根的BQ9均为阪崎克罗诺杆菌（C.sakazakii），MLST分型均为ST8型，且只有2个ST位点的差异，两者高度同源，表明该病例和剩余食物间具有密切的关联，是阪崎克罗诺杆菌与此次食源性疾病暴发事件高度关联的重要证
本研究的局限性在于采集的食品及环境样本量不够充分，分离出的克罗诺杆菌菌株不够多且鉴定出了两种不同的克罗诺杆菌。实验室检测只从供餐企业的食品留样中分离出了克罗诺杆菌菌株，虽然学校留样中的美味水饺和某品牌鸡翅根均通过PCR检出克罗诺杆菌核酸阳性，但没有分离到阳性菌株，无法收集更多的实验室证据表明阪崎克罗诺杆菌（C.sakazakii）为此次食源性疾病暴发事件的主要致病因子。我们注意到，在食源性疾病暴发事件中，人类、食品和环境中往往存在多种克罗诺杆菌菌
由于克罗诺杆菌多在婴幼儿配方食品中检出，成人致病风险低，一般不作为成人食源性疾病暴发首要考虑的病原菌。然而，本研究中分子溯源数据提示克罗诺杆菌作为条件致病菌也有可能成为健康成人及青少年急性胃肠炎的致病因子，需要时应评估其在食源性疾病中的致病风险。目前我国在婴幼儿配方食品、婴幼儿谷物类辅助食品以及环境样本中已广泛检出克罗诺杆菌，因此持续监测食源性疾病人群、食品及环境中的克罗诺杆菌及其分子进化规律十分必要。
对于供餐餐饮公司，我们建议对餐饮环境、餐饮具等进行全面清洁消毒，并常态化开展全环节、全流程的食品安全自查，防止类似聚集性食源性疾病暴发事件的发生；并建议学校、公司等有食堂的大型场所持续做好学生/员工缺勤监测，及时发现并报告出现相关症状的学生/员工信息，配合作好事件流行病学调查和疫情处置工作。
| 《中国食品卫生杂志》顾问及第五届编委会名单 | |
| 顾问：陈君石、黄璐琦、江桂斌、李林、沈建忠、吴清平、Jianghong Meng（美国）、Patrick Wall（爱尔兰）、Samuel Godefroy（加拿大）、Gerald Moy（美国）、Paul Brent（澳大利亚）、Marta Hugas（比利时）、Yukikko Yamada（日本）、Tom Heilandt（德国）、Andreas Hensel（德国）、Christopher Elliott（英国）、Christine Nelleman（丹麦） | |
| 主任委员：卢江 | |
| 副主任委员：王竹天、李宁、孙长颢、王涛、谢剑炜、应浩、丁钢强、张峰、张永慧 | |
| 主编：吴永宁 | |
| 编委（按姓氏笔画排序） | |
| 丁钢强（中国疾病预防控制中心营养与健康所） | 应浩（中国科学院上海营养与健康所） |
| 于洲（国家食品安全风险评估中心） | 张丁（河南省疾病预防控制中心） |
| 于维森（青岛市疾病预防控制中心） | 张峰（中国检验检疫科学研究院） |
| 马宁（国家食品安全风险评估中心） | 张卫兵（南通市疾病预防控制中心） |
| 马会来（中国疾病预防控制中心） | 张立实（四川大学华西公共卫生学院） |
| 马群飞（福建省疾病预防控制中心） | 张永慧（广东省疾病预防控制中心） |
| 王君（国家食品安全风险评估中心） | 张旭东（国家卫生健康委员会医院管理研究所） |
| 王茵（浙江省医学科学院） | 张剑峰（黑龙江省疾病预防控制中心） |
| 王涛（浙江清华长三角研究院） | 张朝晖（中国海关科学技术研究中心） |
| 王硕（南开大学医学院） | 张惠媛（中国海关科学技术研究中心） |
| 王慧（上海交通大学公共卫生学院） | 张遵真（四川大学华西公共卫生学院） |
| 王永芳（国家卫生健康委员会卫生健康监督中心） | 陈波（湖南师范大学化学化工学院） |
| 王竹天（国家食品安全风险评估中心） | 陈颖（中国检验检疫科学研究院） |
| 王松雪（国家粮食和物资储备局科学研究院） | 陈卫东（广东省市场监督管理局） |
| 王晓英（中国动物疫病预防控制中心） | 邵兵（北京市疾病预防控制中心） |
| 计融（国家食品安全风险评估中心） | 武爱波（中国科学院上海营养与健康所） |
| 邓小玲（广东省疾病预防控制中心） | 赵舰（重庆市疾病预防控制中心） |
| 卢江（国家食品安全风险评估中心） | 赵云峰（国家食品安全风险评估中心） |
| 匡华（江南大学食品学院） | 赵贵明（中国检验检疫科学研究院） |
| 朱心强（浙江大学医学院） | 钟凯（科信食品与营养信息交流中心） |
| 刘弘（上海市疾病预防控制中心） | 姜毓君（东北农业大学食品学院） |
| 刘长青（河北省疾病预防控制中心） | 聂俊雄（常德市疾病预防控制中心） |
| 刘成伟（江西省疾病预防控制中心） | 贾旭东（国家食品安全风险评估中心） |
| 刘兆平（国家食品安全风险评估中心） | 徐娇（国家卫生健康委员会食品标准与监测评估司） |
| 刘守钦（济南市疾病预防控制中心） | 徐海滨（国家食品安全风险评估中心） |
| 刘烈刚（华中科技大学公共卫生学院） | 高志贤（军事科学院军事医学研究院） |
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参考文献
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