摘要
采用多重荧光PCR、微量肉汤稀释法、脉冲场凝胶电泳（PFGE）分别对204株分离自无锡市各类监测样本中的副溶血性弧菌进行tlh/tdh/trh毒力基因检测、耐药试验和分子分型。数据比较采用
204株菌tlh基因携带率为100%（204/204），tdh基因携带率为82.35%（168/204），trh基因携带率为2.45%（5/204），食品及环境分离株与病患分离株tdh基因携带率差异具有统计学意义（P<0.001）。菌株对头孢唑啉耐药率最高达96.08%（196/204），对3种及以上抗菌药物的耐药率为2.94%（6/204），食品及环境分离株与病患分离株对氨苄西林、四环素、磺胺甲𫫇唑/甲氧苄啶、环丙沙星耐药率差异具统计学意义（P<0.05）；204株副溶血性弧菌经过聚类分析，分为123个PFGE带型，相似度49.1%~100.0%，按85%的相似度聚类可分为18个带型簇。
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一种嗜盐性弧菌，广泛存在于海水和各类海产品中，是我国沿海地区食物中毒高发的食源性病原菌，会导致腹痛、呕吐、腹泻。但监测结果表明，淡水产品中副溶血性弧菌污染率也一直维持在较高水平，并呈现上升趋
选取204株2016—2021年分离自无锡市各类监测样本中的副溶血性弧菌，包括24株食品及环境分离株（食物中毒相关样本9份，食品风险监测样品15份，涵盖鱼、虾、蚌等食品样本和环境或食品加工环节涂抹样）和180份腹泻病人分离菌株（各监测点分离株122株及食物中毒事件分离株58株）［伦审（2021）第11号］，见
| 时间/年 | 病患分离株/株 | 食品及环境分离株/株 | 总计/株 |
|---|---|---|---|
| 2016 | 36 | 11 | 47 |
| 2017 | 37 | 3 | 40 |
| 2018 | 34 | 2 | 36 |
| 2019 | 32 | 2 | 34 |
| 2020 | 7 | 2 | 9 |
| 2021 | 34 | 4 | 38 |
| 合计 | 180 | 24 | 204 |
全自动药敏加样判读系统（美国赛默飞世尔科技公司），Xba Ⅰ、Not Ⅰ内切酶（北京索莱宝科技有限公司），VITEK 2 Compact细菌鉴定仪、微生物质谱鉴定系统（法国梅里埃公司），AB QuantStudio 7 Pro荧光定量PCR仪（美国ABI公司），Bio-Rad 脉冲场凝胶电泳仪、Bio-Rad Gel Dox XR 凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。
3%氯化钠碱性蛋白胨水、弧菌显色培养基平板、TCBS平板（北京陆桥技术股份有限公司），副溶血性弧菌三重核酸检测试剂盒（深圳生科源生物有限公司）。
参照GB 4789.7—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》和《国家食源性疾病监测工作手册》进行分离鉴定。粪便样本接种于3%氯化钠碱性蛋白胨水，环境水样采用10倍碱性蛋白胨水50 mL+450 mL水样，食品样本取25 g置于225 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水，以上样本经36 ℃增菌8~18 h。取增菌液分别划线接种于弧菌显色培养基和TCBS平板上，经36 ℃ 18~24 h。挑取可疑菌落使用生化鉴定仪或微生物质谱鉴定。
采用微量肉汤稀释法，测定副溶血性弧菌对12种抗菌药物的最低抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration，MIC）。抗菌药物包括青霉素类：氨苄西林（Ampicillin，AMP）、氨苄西林/舒巴坦（Ampicillin/sulbactam，AMS），头孢类：头孢噻肟（Cefotaxime，CTX）、头孢他啶（Ceftazidime，CAZ）、头孢唑啉（Cefazolin，CFZ），头霉素类：头孢西丁（Cefoxitin，FOX），碳青霉烯类：亚胺培南（Imipenem，IPM），四环素类：四环素（Tetracycline，TET），磺胺类：磺胺甲𫫇唑/甲氧苄啶（Trimethoprim-sulfamethoxazole，SXT），氨基糖苷类：庆大霉素（Gentamicin，GEN），氯霉素类：氯霉素（Chloramphenicol，CHL），喹诺酮类：环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）。质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC 25922。根据美国临床和实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2021 M10
参照PulseNet网络实验室副溶血性弧菌脉冲场凝胶电泳标准方法对204株菌进行脉冲场凝胶电泳（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE）试验，分子量标记为沙门菌H9812，用限制性内切酶Xba Ⅰ进行酶切，副溶血性弧菌使用Not Ⅰ进行酶切，置于37 ℃酶切4 h。设置电泳参数（电压：6 V/cm，脉冲时间：10~35.03 s，线性转换，电场角度120°，初始电流：110~140 mA，电泳时间：18.7 h，电泳液温度14 ℃）。电泳完成后使用GelRed染色，纯水清洗，凝胶成像系统拍照。使用BioNumerics 6.0软件，采用UPGMA法对电泳图谱进行聚类分析，电泳条带位置优化度为1.5%。
24株食品及环境分离株中，tdh基因携带率为29.17%（7/24），无携带trh基因的菌株。180株病患分离株中，tdh基因携带率为89.44%（161/180），trh基因携带率为2.78%（5/180）。经
| 毒力基因 | 食品及环境（n=24） | 病患（n=180） | P | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 菌株数 | 携带率/% | 菌株数 | 携带率/% | |||
| tlh | 24 | 100.00 | 180 | 100.00 | 0 | 1 |
| tdh | 7 | 29.17 | 161 | 89.44 | 52.944 | <0.001 |
| trh | 0 | 0.00 | 5 | 2.78 | 0.683 | 0.409 |
204株副溶血性弧菌对头孢唑啉的耐药率最高，达96.08%（196/204），其次是氨苄西林，达3.43%（7/204），对氨苄西林/舒巴坦、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁、亚胺培南、四环素、磺胺甲𫫇唑/甲氧苄啶、庆大霉素、氯霉素、环丙沙星敏感率均大于95%；对氨苄西林中介率最高，达32.84%（67/204），结果见
| 抗菌药物名称 | 耐药率/[%(n)] | 中介率/[%(n)] | 敏感率/[%(n)] |
|---|---|---|---|
| 氨苄西林 | 3.43(7/204） | 32.84(67/204) | 63.73(130/204) |
| 氨苄西林/舒巴坦 | 0.49(1/204) | 0.49(1/204) | 99.02(202/204) |
| 头孢噻肟 | 0.98(2/204) | 0 | 99.02(202/204) |
| 头孢他啶 | 0.49(1/204) | 0 | 99.51(203/204) |
| 头孢唑啉 | 96.08(196/204) | 1.47(3/204) | 2.45(5/204) |
| 头孢西丁 | 0 | 2.94(6/204) | 97.06(198/204) |
| 亚胺培南 | 0 | 0 | 100(204/204) |
| 四环素 | 1.96(4/204) | 0 | 98.04(200/204) |
| 磺胺甲𫫇唑/甲氧苄啶 | 1.96(4/204) | 0 | 98.04(200/204) |
| 庆大霉素 | 0 | 0 | 100(204/204) |
| 氯霉素 | 0 | 0.49(1/204) | 99.51(203/204) |
| 环丙沙星 | 1.96(4/204) | 0 | 98.04(200/204) |
24株食物及环境分离株中，菌株对头孢唑啉耐药率最高，达100%（24/24）；其次为氨苄西林，达16.67%（4/24）。180株病患分离株对头孢唑啉耐药率最高，达95.56%（172/180）；对氨苄西林耐药率为1.67%（3/180）。两组来源除对氨苄西林、四环素、磺胺甲𫫇唑/甲氧苄啶、环丙沙星的耐药率差异有统计学意义（
| 抗菌药物名称 | 食品及环境（n =24） | 病患（n=180） | P | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 菌株数 | 耐药率/% | 菌株数 | 耐药率/% | |||
| 氨苄西林 | 4 | 16.67 | 3 | 1.67 | 14.379 | <0.001 |
| 氨苄西林/舒巴坦 | 0 | 0.00 | 1 | 0.56 | 0.134 | 0.714 |
| 头孢噻肟 | 0 | 0.00 | 2 | 1.11 | 0.269 | 0.604 |
| 头孢他啶 | 0 | 0.00 | 1 | 0.56 | 0.134 | 0.714 |
| 头孢唑啉 | 24 | 100.00 | 172 | 95.56 | 1.110 | 0.292 |
| 头孢西丁 | 0 | 0.00 | 0 | 0.00 | — | — |
| 亚胺培南 | 0 | 0.00 | 0 | 0.00 | — | — |
| 四环素 | 2 | 8.33 | 2 | 1.11 | 5.746 | 0.017 |
| 磺胺甲𫫇唑/甲氧苄啶 | 2 | 8.33 | 2 | 1.11 | 5.746 | 0.017 |
| 庆大霉素 | 0 | 0.00 | 0 | 0.00 | — | — |
| 氯霉素 | 0 | 0.00 | 0 | 0.00 | — | — |
| 环丙沙星 | 2 | 8.33 | 2 | 1.11 | 5.746 | 0.017 |
注： —表示无分类或者无数值
2016—2021年头孢唑啉耐药率一直保持较高水平（>85%），至2018年开始其耐药率逐年下降［2016年100%（47/47）、2017年100%（40/40）、2018年97.22%（35/36）、2019年97.06%（33/34）、2020年88.89%（8/9）、2021年86.84%（33/38）］；其他抗生素的耐药主要在2016、2018和2019年出现，结果见
| 抗菌药物名称 | 2016年 | 2017年 | 2018年 | 2019年 | 2020年 | 2021年 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 氨苄西林 | 8.51(4/47) | 0.00 | 2.78(1/36) | 5.88(2/34) | 0.00 | 0.00 |
| 氨苄西林/舒巴坦 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 2.94(1/34) | 0.00 | 0.00 |
| 头孢噻污 | 0.00 | 0.00 | 5.56(2/36) | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| 头孢他啶 | 0.00 | 0.00 | 2.78(1/36) | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| 头孢唑啉 | 100(47/47) | 100(40/40) | 97.22(35/36) | 97.06(33/34) | 88.89(8/9) | 86.84(33/38) |
| 头孢西丁 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| 亚胺培南 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| 四环素 | 6.38(3/47) | 0.00 | 2.78(1/36) | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| 甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲𫫇唑 | 6.38(3/47) | 0.00 | 2.78(1/36) | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| 庆大霉素 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| 氯霉素 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| 环丙沙星 | 6.38(3/47) | 0.00 | 2.78(1/36) | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
204株副溶血性弧菌耐药谱见
| 耐药谱 | 耐药菌株数 | 占比/[(%)n] |
|---|---|---|
| — | 8 | 3.92(8/204) |
| CFZ | 184 | 90.20(184/204) |
| CFZ-AMP | 6 | 2.94(6/204) |
| CFZ-AMS-AMP | 1 | 0.49(1/204) |
| CFZ-CTX-CAZ | 1 | 0.49(1/204) |
| CFZ-TET-SXT-CIP | 2 | 0.98(2/204) |
| CFZ-TET-SXT-CIP | 1 | 0.49(1/204) |
| CFZ-TET-CIP-SXT-CTX | 1 | 0.49(1/204) |
| 合计 | 204 | 100(204/204) |
注： —表示无分类或者无数值
| 抗菌药物种类 | 菌株数 | 年份 | 分类 | 耐药谱 | 构成比 |
|---|---|---|---|---|---|
| 3 | 1 | 2019 | 病人 | CFZ-AMS-AMP | 1/6 |
| 3 | 1 | 2018 | 病人 | CFZ-CTX-CAZ | 1/6 |
| 4 | 2 | 2016 | 食品 | CFZ-TET-SXT-CIP | 2/6 |
| 4 | 1 | 2016 | 病人 | CFZ-TET-SXT-CIP | 1/6 |
| 5 | 1 | 2018 | 病人 | CFZ-TET-CIP-SXT-CTX | 1/6 |
204株副溶血性弧菌经聚类分析可分为123个PFGE带型，命名为N1～N123，各带型包含的菌株数在1~17株不等，相似度在49.1%~100.0%之间。其中N37包含17株菌；N70包含11株菌；N72包含10株菌；N46包含8株菌；N41和N51各包含7株菌；N65和N66各包含5株菌；N89和N110各包含4株菌；N19包含3株菌；N28、N33、N36、N38、N43、N44、N48、N53、N63、N73、N76各包含2株菌；其余101种带型仅包含1株菌，整体优势不明显。主要带型的菌株信息、耐药谱及毒力携带情况见
| 带型 | 菌株数 | 年份 | 来源 | 耐药谱 | 毒力基因 |
|---|---|---|---|---|---|
| N37 | 17 | 2017、2018 | 哨点医院腹泻病人 | CFZ | tlh+，tdh+，trh- |
| N70 | 11 | 2021 | 食物中毒（病人、环境涂抹样、从业人员） | CFZ | tlh+，tdh+，trh- |
| N72 | 10 | 2021 | 食物中毒（病人） | —；CFZ | tlh+，tdh+，trh- |
| N46 | 8 | 2016、2018 | 哨点医院腹泻病人 | CFZ | tlh+，tdh+，trh- |
| N41 | 7 | 2017 | 腹泻病人 | CFZ | tlh+，tdh+，trh- |
| N51 | 7 | 2016 | 腹泻病人 | CFZ | tlh+，tdh+，trh- |
| N65 | 5 | 2021 | 食物中毒[病人、食品（盐水毛豆）] | CFZ |
tlh+，tdh+，trh-； tlh+，tdh-，trh- |
| N66 | 5 | 2021 | 食物中毒（病人）、哨点医院腹泻病人 | CFZ | tlh+，tdh+，trh- |
| N89 | 4 | 2017、2018 | 哨点医院腹泻病人 | CFZ | tlh+，tdh+，trh- |
| N110 | 4 | 2017 | 哨点医院腹泻病人 | —；CFZ；CFZ-AMP | tlh+，tdh+，trh+ |
按85%的相似度将123个PFGE带型可分为18个带型簇，分别命名为clusterA～clusterR，其中clusterD中包含的菌株最多，有69株，涵盖带型N33～N57，见
图 1 204株副溶血性弧菌聚类分析图
Figure 1 Cluster analysis of 204 strains of Vibrio parahaemolyticus
注： A~R：按85%的相似度将123个PFGE带型可分为18个带型簇，分别命名为clusterA～clusterR
副溶血性弧菌分泌的溶血素为其主要致病因子，分不耐热溶血毒素（Thermolabile hemolysin，TLH）和耐热性直接溶血素（Thermostable direct hemolysin，TDH）或耐热性直接溶血素相关溶血素（Thermostable direct hemolysin-related hemolysin，TRH），由tlh、tdh、trh基因编
本研究药敏结果提示无锡市副溶血性弧菌对头孢唑啉耐药率最高，达96.08%，与国内其他地
PFGE被公认为细菌分型及追踪传染源最有效的方法之一，本研究对无锡市不同来源的204株副溶血性弧菌进行PFGE分型，可分为123个带型，具较大的遗传多样性。其中2021年某起食物中毒事件的11株菌均属于同一带型N70，包括6株病患分离株、2株从业人员分离株和3株厨房环境涂抹样（冷菜间菜盘和刀具）分离株，其耐药谱和毒力基因携带情况均一致，结合流行病学调查可推断该起食物中毒是由从业人员携带的副溶血性弧菌污染厨房环境引起。123个带型按85%相似度可分为18个带型簇，分别命名为clusterA~clusterR。其中clusterD包括的菌株数最多，有69株，涵盖带型N33~N57，其耐药谱和毒力基因携带情况完全一致，且均来源于2016年（19株）、2017年（24株）、2018年（24株）的病患分离株，因此可认为，clusterD带型簇是2016—2018年无锡地区副溶血性弧菌在腹泻病人体内流行的优势克隆群。2019年的副溶血性弧菌带型簇较分散（clusterB、clusterI、clusterJ、clusterP），2020年受新冠疫情影响菌株收集太少，均无法判断流行的优势菌株。2021年副溶血性弧菌的流行菌株主要集中在clusterG（16株）和clusterH（21株），两者同源性84.4%，说明副溶血性弧菌在流行过程中一直伴随着变异发生；clusterH中的菌株均分离自食物中毒的病人、环境、从业人员等，具有可溯源性，可为食物中毒的传染源判定提供依据，也显示了clusterH带型簇克隆是2021年引起副溶血性弧菌性食物中毒事件的主要流行株。
本研究所涉食品及环境样本相对较少，具有局限性，特别是在食物中毒事件调查溯源中，对于剩余食品的采集不可忽视；对不同来源的菌株今后可联合基因测序技术，进一步了解其进化特征，为协助流行病学调查确定传染源，及时采取干预措施提供依据。
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