摘要
采集中国市场在售代表性豆豉37种，用宏基因组测序技术分析微生物信息，用非度量多维尺度分析（NMDS）将信息进行降维、分析和归类。使用PERMANOVA评估不同地区之间的群落差异是否显著，使用Mantel Test分析地理距离和微生物群之间的关系，用LEfSe估计每个差异的影响程度。同时构建共同丰度的微生物物种网络，分析微生物之间的相互作用。
不同地区豆豉微生物多样性不同，华中地区豆豉的微生物多样性相对较高。Mantel Test分析表明，豆豉中菌群距离与地理距离呈高度相关。豆豉含有的细菌中，优势门为厚壁菌门（平均丰度80.9%），最丰富的目为芽孢杆菌目（平均丰度66%），含量最丰富的属为芽孢杆菌属（50.3%）。研究发现在中国的豆豉中有益菌和食源性致病菌是共同存在的，主要的有益菌包括芽孢菌以及各种产乳酸菌，食源性致病菌包括肠沙门菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和阪崎氏年轻泰坦杆菌等。在物种网络中，芽孢杆菌目相互之间可能形成协同关系，而芽孢杆菌目与其他目的微生物特别是乳酸菌目的物种之间存在相互竞争。
豆豉是我国的传统发酵食
高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司），Illumina NovaSeq6000（美国Illumina公司），超声波清洗仪（上海必能信超声有限公司），漩涡器（德国IKA公司），NanoDrop™ 8000分光光度计（美国赛默飞），Qubit 4.0荧光定量仪（生命技术公司）。
HyperPlus试剂盒（美国KAPA生物技术公司），QIAamp PowerFecal Pro DNA试剂盒（QINEN公司）。
采用DNeasy PowerSoil Pro Kit 提取试剂盒进行样品中DNA提取，然后用Thermo NanoDrop 8000分光光度计、Life Technologies Qubit 4.0和琼脂糖凝胶电泳进行DNA检测。使用HyperPlus无聚合酶链反应构建文库，文库DNA片段平均大小350 bp。
采用MOCAT
为揭示豆豉中微生物物种之间的关系，构建共同丰度的微生物物种网络。将来自Kraken2的物种读取计数数据用R包FastSpar进行分
用R中的vegan包进行计算α多样性指
综合考虑加工工艺、地域、销量、原料、风味等因素，共选取全国有代表性的37种豆豉。其中华南地区7个，西南地区16个，华中地区8个，华东地区6个；工艺上毛霉型豆豉6种，米曲霉型12种，细菌型7种，其他12种；原料上黑豆型豆豉16种，黄豆型豆豉21种。
4个主要产生地区的豆豉微生物多样性存在差异（Kruskal-Wallis H检验，P=0.066），华中地区豆豉的微生物多样性相对较高（
图 1 豆豉中微生物的多样性
Figure 1 Diversity of microorganisms in Douchi
注： A：4个地区豆豉多样性比较；B：4个地区的beta多样性分析结果；C：地理距离与菌群距离之间的关系
在豆豉菌群组成上，细菌占比更大，其次是真菌。基于Kraken2的结果，用比对到的读长计数大于500作为物种出现真阳性的阈值，共发现真菌18种，唯一出现在所有豆豉样本中的真菌是米曲霉菌（Aspergillus oryzae）。而在细菌中可发现474种，共同出现在所有豆豉的细菌主要来自芽孢杆菌属（Bacillus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）（
图 2 不同地区细菌（A）和真菌（B）之间的交集
Figure 2 Intersection between bacteria (A) and fungi (B) in different regions
图 3 不同地区豆豉微生物组成
Figure 3 Microbial composition of Douchi in different regions
注： A：界；B：门；C：目；D：属
采用LEfSe进一步分析在不同地区豆豉微生物富集情况发现，在界水平，西南地区豆豉中主要是噬菌体病毒比较富集。另外，西南地区豆豉也富集了比较多的芽孢杆菌属的物种。华南地区豆豉中富集了放线菌门（Actinobacteria）的物种。华中地区豆豉富集了芽孢杆菌属（Bacillus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）的物种。华东地区豆豉最丰富的物种为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）（
图 4 LEfSe结果（LDA score > 3）
Figure 4 Linear discriminant analysis Effect Size
本研究发现在中国的发酵豆制品中有益菌和食源性致病菌是共同存在的，主要的有益菌包括芽孢菌以及各种产乳酸菌。芽孢菌如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）等，这些菌本身用于食物的发酵。产乳酸菌主要来自乳酸菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）明串珠菌属（Leuconostoc）、链球菌属（Streptococcus）和魏氏菌属（Weissella）（
图 5 中国发酵豆制品中的有益菌（A）和食源性致病菌（B）
Figure 5 Beneficial bacteria (A) and foodborne pathogens (B) in fermented soybean products from China
在物种网络分析中，共发现豆豉有48个共同丰度，在目的水平进行分析，芽孢杆菌目相互之间可能形成协同关系，而芽孢杆菌目与其他目的微生物包括乳酸菌目之间相互竞争。经过聚类，我们观察到物种倾向于按其分类顺序关系聚类，在豆豉网络中，芽孢属内物种，包括解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）与贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）等两两直接表现为正相关，而枯草芽孢杆菌与乳酸菌类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）与乳酸菌融合魏斯氏菌（Weissella confusa）、米曲霉菌（Aspergillus oryzae）则与多种芽孢属物种表现为负相关（
图 6 豆豉中微生物相互作用网络
Figure 6 Microbial interaction network in Douchi
中国不同地区豆豉微生物构成存在明显差异。中国甘肃省的两个传统豆豉微生物多样性研究表
厚壁菌门和变形菌门通常存在于中国豆豉中。以往研究表
本研究发现，有益菌和食源性致病菌共同存在于豆豉中。豆豉中枯草芽孢杆菌可以合成维生素K
本研究发现，不同目之间的微生物形成了相互拮抗的关系。在其他生态系统中这种拮抗关系也同样存在，体外动物实验表明，乳酸杆菌属对肺炎克雷伯菌有抑制作
本研究通过宏基因组测序研究了豆豉中的细菌和真菌多样性，明确了不同地区豆豉优势门、属、种的细菌，确定不同地区豆豉的特征微生物以及其中的有益菌和有害菌，并初步探究了这些微生物的共丰度关系。研究结果提供了豆豉微生物群落多样性的数据，可用于指导豆豉的工业化生产。
| 《中国食品卫生杂志》顾问及第五届编委会名单 | |
| 顾问：陈君石、黄璐琦、江桂斌、李林、沈建忠、吴清平、Jianghong Meng（美国）、Patrick Wall（爱尔兰）、Samuel Godefroy（加拿大）、Gerald Moy（美国）、Paul Brent（澳大利亚）、Marta Hugas（比利时）、Yukikko Yamada（日本）、Tom Heilandt（德国）、Andreas Hensel（德国）、Christopher Elliott（英国）、Christine Nelleman（丹麦） | |
| 主任委员：卢江 | |
| 副主任委员：王竹天、李宁、孙长颢、王涛、谢剑炜、应浩、丁钢强、张峰、张永慧 | |
| 主编：吴永宁 | |
| 编委（按姓氏笔画排序） | |
| 丁钢强（中国疾病预防控制中心营养与健康所） | 应浩（中国科学院上海营养与健康所） |
| 于洲（国家食品安全风险评估中心） | 张丁（河南省疾病预防控制中心） |
| 于维森（青岛市疾病预防控制中心） | 张峰（中国检验检疫科学研究院） |
| 马宁（国家食品安全风险评估中心） | 张卫兵（南通市疾病预防控制中心） |
| 马会来（中国疾病预防控制中心） | 张立实（四川大学华西公共卫生学院） |
| 马群飞（福建省疾病预防控制中心） | 张永慧（广东省疾病预防控制中心） |
| 王君（国家食品安全风险评估中心） | 张旭东（国家卫生健康委员会医院管理研究所） |
| 王茵（浙江省医学科学院） | 张剑峰（黑龙江省疾病预防控制中心） |
| 王涛（浙江清华长三角研究院） | 张朝晖（中国海关科学技术研究中心） |
| 王硕（南开大学医学院） | 张惠媛（中国海关科学技术研究中心） |
| 王慧（上海交通大学公共卫生学院） | 张遵真（四川大学华西公共卫生学院） |
| 王永芳（国家卫生健康委员会卫生健康监督中心） | 陈波（湖南师范大学化学化工学院） |
| 王竹天（国家食品安全风险评估中心） | 陈颖（中国检验检疫科学研究院） |
| 王松雪（国家粮食和物资储备局科学研究院） | 陈卫东（广东省市场监督管理局） |
| 王晓英（中国动物疫病预防控制中心） | 邵兵（北京市疾病预防控制中心） |
| 计融（国家食品安全风险评估中心） | 武爱波（中国科学院上海营养与健康所） |
| 邓小玲（广东省疾病预防控制中心） | 赵舰（重庆市疾病预防控制中心） |
| 卢江（国家食品安全风险评估中心） | 赵云峰（国家食品安全风险评估中心） |
| 匡华（江南大学食品学院） | 赵贵明（中国检验检疫科学研究院） |
| 朱心强（浙江大学医学院） | 钟凯（科信食品与营养信息交流中心） |
| （下转第1474页） | |
参考文献
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