重组酶聚合酶扩增技术快速检测猪肉及其制品中ASFV、PDCoV和SVA

舒佳新，陈传君，谢礼，张婧，安微，杨苗，郑晶，帅培强，余姓鸿，郑巧，韩国全，林华; SHU Jiaxin; CHEN Chuanjun; XIE Li; ZHANG Jing; AN Wei; YANG Miao; ZHENG Jing; SHUAI Peiqiang; YU Xinghong; ZHENG Qiao; HAN Guoquan; LIN Hua

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重组酶聚合酶扩增技术快速检测猪肉及其制品中ASFV、PDCoV和SVA PDF

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1. 四川农业大学食品学院，四川雅安 625014； 2. 成都海关技术中心，四川成都 610041

中图分类号： R155

最近更新：2023-11-17

DOI：10.13590/j.cjfh.2023.07.007

摘要

目的

建立非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪Delta冠状病毒（PDCoV）和A型塞内卡病毒（SVA）多重重组酶聚合酶扩增（RPA）快速检测方法。

方法

以重组质粒为模板进行RPA检测，并优化温度、时间、引物探针配比等反应条件，建立多重RPA检测方法，应用于实际样本的检测；与实时荧光聚合酶链式反应（qPCR）结果对比，评价所建立方法的准确率。

结果

本方法可在20 min内实现对3种病毒的同时检测，特异性良好；对ASFV、PDCoV、SVA灵敏度分别为940、770、570 copies/µL；用于实际核酸样本检测，准确率分别为93.33%、100.00%、100.00%。

结论

本文建立的多重RPA方法快速、便捷，适合猪肉及其制品中ASFV、PDCoV、SVA的现场初筛。

关键词

重组酶聚合酶扩增技术; 非洲猪瘟病毒; A型塞内卡病毒; 猪Delta冠状病毒

猪肉是人类机体补充蛋白质的重要来源，一直以来在我国的传统饮食文化中占据重要地位。我国养殖业处于向规模化养殖转型的快速发展阶段，生猪及猪肉制品进出口体量大，微生物污染风险贯穿供应链始终，外来传染性疫病易通过猪群迅速传播蔓延，产生公共卫生安全问题，既可能严重影响养殖业，同时致使消费者面临食品原料肉安全风险问题。

我国作为猪肉生产贸易大国，保障猪肉及其制品的食用安全性关乎民生问题，需从源头上控制原料猪肉的质量安全。生鲜猪肉及其制品流通环节复杂、国际贸易量大，若携带动物疫病病原，则有成为病原传播风险点的可能。快速准确检测相关病毒方法的研究对于外来疫病防控与肉类检疫具有现实意义，可切断传染源，保证肉制品流通安全，保障养殖业健康发展。

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引发，被世界动物卫生组织（World Organization for Animal Health，WOAH）列入法定通报动物疫病名录，我国将其列为一类动物疫病，自2018年传入以来，对我国生猪养殖、畜产品贸易等造成巨大负面冲击，而猪肉、水饺、香肠、猪血等食品中检出ASFV事件的出现，引发居民高度关注^［

1-3］。广泛流行的外来动物疫病猪Delta冠状病毒（Porcine Delta coronavirus，PDCoV）和A型塞内卡病毒（Seneca virus type A，SVA）为RNA病毒，具有强重组和变异能力，可导致仔猪死亡^{［参考文献 4-5}4-5］，病死猪作为原料流入市场将影响食品安全，引起专业领域重视。此外，PDCoV可能存在禽类与哺乳动物间的种间传播，不能排除人类因接触受污染的猪而感染的可能^{［参考文献 6

百度学术}6］。迄今为止，仍无针对此3种病毒的商品化疫苗，因此对其进行快速准确诊断和鉴定尤为重要。

重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification，RPA）技术是一种新型快速核酸等温扩增技术，在体系中由两个相对的引物起始一个合成事件，整个过程进行迅速，一般可在数十分钟之内获得可检出水平的扩增产物^［

7-8］。其简化的扩增条件在很大程度上降低了对复杂仪器的依赖^{［参考文献 9

百度学术}9］，实时荧光RPA方法是在RPA基础上添加荧光标记并引入四氢呋喃（Tetrahydrofuran，THF）修饰位点的exo探针及核酸外切酶Ⅲ（Exonuclease Ⅲ，Exo Ⅲ），当探针与扩增产物内的靶序列杂交时，Exo Ⅲ在THF位点裂解探针，从而导致荧光基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，实现扩增产物可视化实时监测^{［参考文献 10

百度学术}10］。目前，RPA技术已被用于食源性病毒^{［参考文献 11

百度学术}11］、食源性致病菌^{［参考文献 12

百度学术}12］、转基因植物^{［参考文献 13

百度学术}13］、肉制品掺假^{［参考文献 14

百度学术}14］等方面的检测。目前研究建立的RPA方法可用于不同病毒检测^{［参考文献 15-17}15-17］，但多见于单重RPA，不能完全满足养殖单位一线检疫、食品生产企业自检、海关监管现场快检等情景。

本研究基于RPA技术，建立可同时检测ASFV、PDCoV及SVA的快速检测方法，以期推广至其他重大外来疫病病原的多重检测，同时为病原检测提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

猪肉或其制品实际样本24份（由成都口岸海关于2019年10~12月截获）、ASFV阳性核酸样本6份（由猪肉制品提取总核酸获得并经四川省动物疫病预防控制中心验证）、猪瘟病毒（Classical swine sever virus，CSFV）、猪圆环病毒1型（Porcine circovirus-1，PCV-1）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus-2，PCV-2）、伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、猪蓝耳病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus infection virus，PPI）病毒核酸共6份，均由成都海关技术中心动检实验室保存并提供，所有样本于-75 ℃保存。

1.1.2 主要仪器与试剂

NanoDrop微量核酸蛋白仪、Kingfisher Ouo Prime全自动核酸提取仪、高速冷冻离心机（美国Thermo），样品研磨器（美国MP FastPrep），7500FAST定量PCR仪（美国ABI），FQD-16A便携式PCR仪（博日生物）。

TwistAmp^® exo试剂盒（英国TwistDX），质粒小提试剂盒、TIANGEN^® 磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒、RNase-Free ddH₂O（北京天根生化科技有限公司），PrimeScript^TM RT reagent Kit（Perfect Real Time）反转录试剂盒（TAKARA宝生物工程有限公司），引物、探针由上海生工生物公司合成，质粒穿刺菌（pUC57）由北京六合华大基因生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物探针的筛选

根据ASFV P54基因、PDCoV N基因和SVA全基因组序列，通过NCBI在线工具进行序列分析和比对，利用Primer 6软件设计引物5组引物探针，并用TwistAmp^® exo试剂盒筛选。将体系加入含冻干酶的反应管中，包括：Primer Free Rehydration buffer 29.5 µL、上下游引物（浓度为10 nmol/µL）各2.1 µL、TwistAMP^®exo探针（浓度为10 nmol/µL）0.6 µL、模板2 µL、RNase-Free ddH₂O 11.2 µL，最后加入MgOAc 2.5 µL（280 mmol/L），充分混匀后置于FQD-16A PCR仪中39 ℃恒温预热4 min，取出反应管充分颠倒混匀并瞬时离心，重置后继续等温扩增反应，反应程序设置每20 s为一循环，收集荧光信号，共计20 min。每个反应设置3个平行，并以RNase-Free ddH₂O作为空白对照。

1.2.2 重组质粒的制备

将质粒穿刺菌划线培养后挑单菌落进行扩大培养，使用质粒小提试剂盒提取其DNA，冻存于-75 ℃待用，用核酸蛋白测定仪测定质粒浓度。DNA拷贝数计算公式如下：

模板 拷贝 数 = \frac{质粒 D N A 浓度 \times 10^{- 9} \times 6.02 \times 10^{23}}{(载体 长度 + 目的 基因 长度) \times 660}

(1)

1.2.3 多重实时荧光 RPA 方法的建立及优化

使用TwistAmp^® exo试剂盒建立多重实时荧光RPA方法，根据试剂盒说明书以及预实验结果配制反应体系（50 µL）：Primer Free Rehydration buffer 29.5 µL，ASFV、PDCoV、SVA上下游引物各1.5 µL，探针各0.5 µL，模板2 µL（ASFV、PDCoV、SVA质粒核酸提取物用RNase-Free ddH₂O稀释至10^-7），RNase-Free ddH₂O 5.5 µL，MgOAc 2.5 µL。对多重 RPA 反应体系和条件，包括扩增时间（10~60 min）、温度（37~41 ℃）、引物探针配比进行优化，反应过程同1.2.1，确定最佳反应体系和条件，以RNase-Free ddH₂O作为空白对照。

1.2.4 特异性试验

采用1.2.3确定的反应体系和参数检测ASFV、PDCoV、SVA质粒（稀释度为10^-7）、CSFV、PCV-Ⅰ、PCV-Ⅱ、PRV、PRRSV、PPI核酸（CSFV、PRRSV为RNA病毒，按试剂盒说明书进行反转录为cDNA后作为模板），对多重RPA检测方法的特异性进行评估。

1.2.5 灵敏度及稳定性试验

将ASFV、PDCoV、SVA质粒核酸提取物分别用RNase-Free ddH₂O以10^-7、10^-8、10^-9、10^-10进行系列稀释，根据公式（1）计算拷贝数，各病毒质粒稀释液逐一作为模板，采用1.2.3优化后的反应体系和参数进行RPA反应，统计其拷贝数，能检测到荧光信号的最低拷贝数浓度即为该方法的灵敏度，每个浓度进行3次检验以评价该方法的稳定性。

1.2.6 实际样品检测

为了验证建立方法的适用性，对实验室保存的24份猪肉或其制品及6份ASFV阳性核酸样本进行检测。猪肉及其制品在生物安全二级实验室进行取样，用无菌剪刀挑取样品非脂肪、非结缔组织部分约5 g，放入含研磨珠的15 mL离心管中，加入4 mL PBS缓冲溶液后进行匀浆处理，使用TIANGEN^®磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒提取核酸，并按照PrimeScript^TM RT reagent Kit（Perfect Real Time）说明书进行反转录后，分别对应采用WOAH推荐qPCR方法^［

18］、出入境检验检疫行业标准方法^{［参考文献 19

百度学术}19］、DALL等^{［参考文献 20

百度学术}20］建立的qPCR方法以及前期建立的单重实时荧光RPA方法（引物探针与本实验相同）和本实验建立的多重实时荧光RPA方法检测。

2 结果

2.1 引物探针筛选

根据ASFV、PDCoV、SVA保守序列分别设计5组引物探针（引物探针序列未给出），并进行相对性能评估，首先配合某一个正向引物筛查所有反向引物，挑选最佳反向引物，再使用其筛查所有正向引物，如此便可以在16~20次反应中找到良好的引物对（图1），首先用上游引物F3对所有下游引物进行筛选，根据结果选择效果最好的下游引物R4对上游引物进行筛选，最终确定符合实时荧光RPA反应检测所需且能够满足使用的引物探针，序列如表1。

图 1 RPA引物筛选示意图

Figure 1 Diagrammatic sketch of RPA primer screening

注： - 为阴性，+ 为阳性，+ 数量代表阳性强弱

表 1 引物探针序列

Table 1 Sequence of primer and probe

名称	引物探针序列	产物长度/bp
ASFV	F-5'-ACTGGCTTGCCTACACTTGCTGTAGTCG-3'	194
	R-5'-ATCGTGGTCTTAGTCATCATTATCATCGTTCT-3'
	P-CTGCTGATCTTGATAAGGATTTATAAACTG[FAM-dT]A[THF]A[BHQ1-dT]CTTCCTCCTCAATAG[C3-spacer]
PDCoV	F-5'-AAGGCTACTCATCCTCAGTTTCGTGGCA-3'	242
	R-5'-GCTCCCGAACCCTTAACCCAAGTAACAC-3'
	P-ACTCCGATTCCTCCATCCTTTGCCTTTTAT[CY5-dT][THF][BHQ1-dT]ACTGGCACAGGTCCC[C3-spacer]
SVA	F-5'-TAGAGGCACAGAGGAGCAACATCCAACC-3'	289
	R-5'-CTCACAGCCATAAAGGGACTAACAGCAT-3'
	P-CTCACTCATTTACACACAAAAACTGTGTTG[HEX-dT]A[THF]C[BHQ1-dT]ACAAGATTTGGCCCT[C3-spacer]

注： FAM-dT、CY5-dT、HEX-dT、BQH-dT、THF和C3-spacer均为探针修饰基团

2.2 重组质粒提取

3种病毒阳性质粒浓度及其拷贝数数据见表2。

表 2 质粒浓度及拷贝数

Table 2 Calculation of plasmid concentration and copy number

	质粒长度/bp	质粒浓度/(ng/µL)	拷贝数/(copies/µL)
ASFV	194	203.0	9.4×10¹⁰
PDCoV	242	205.2	7.7×10¹⁰
SVA	289	199.4	5.7×10¹⁰

2.3 多重RPA反应条件优化

通过对反应时间、温度及引物探针配比进行多重RPA反应优化，最终确定反应体系：Primer Free Rehydration buffer 29.5 µL，ASFV、PDCoV、SVA上下游引物各1.5 µL、探针各0.5 µL，模板2 µL（ASFV、PDCoV、SVA质粒核酸提取物稀释度为10^-7，拷贝数分别为9.4×10³、7.7×10³、5.7×10³copies/µL），MgOAc 2.5 µL，RNase-Free ddH₂O补足50 µL；反应程序：具体参照1.2.1，反应温度为39 ℃，时间为20 min，即60个循环。

在此反应条件下，ASFV、PDCoV、SVA扩增曲线平稳，Ct值相差较小，荧光强度基本相当，满足多重实时荧光RPA反应的需求（图2）。

图 2 最佳反应条件下多重实时荧光RPA结果时间扩增结果

Figure 2 Multiple real-time fluorescence RPA results under optimal reaction conditions

注： 1~3分别为ASFV、SVA、PDCoV质粒（稀释度为10^-7）扩增曲线，4为阴性对照

2.4 特异性实验

对所建立多重实时荧光RPA方法进行特异性测定，在ASFV、PDCoV、SVA、CSFV、PCV-Ⅰ、PCV-Ⅱ、PRV、PRRSV、PPI DNA或cDNA中随机挑选组合1种目标病毒及两种非目标病毒混合作为模板，按照2.3反应条件进行扩增。结果显示仅3种目标病毒出现典型扩增，其他病毒未出现，表明该方法用于同时检测ASFV、PDCoV、SVA具有良好的特异性（图3）。

图 3 多重实时荧光RPA特异性试验

Figure 3 Multiple real-time fluorescence RPA specificity test

注： a、b、c为扩增曲线图，模板组合分别为：ASFV、PCV-Ⅰ、PCV-Ⅱ；PDCoV、PRRSV、PPI；SVA、PPI、PCV-Ⅰ

2.5 灵敏度及稳定性试验

多重实时荧光 RPA 方法检测 ASFV、PDCoV、SVA 灵敏度结果如图4，表明ASFV质粒最大稀释倍数为10^-8时出现典型扩增，即对应检出限为940 copies/µL（图4a）；同样能检测到10^-8倍稀释的PDCoV质粒样品（浓度为770 copies/µL），另外，稀释倍数为10^-9时在第44个循环（13 min，20 s）时扩增信号被检出，但其时间过长且荧光强度低，非典型扩增，不计为阳性，所以该方法检测PDCoV灵敏度为770 copies/µL（图4b）；当SVA质粒样品稀释倍数为10^-8时，荧光强度不高但具有典型扩增曲线，表明多重RPA方法对于SVA灵敏度为570 copies/µL（图4c）。各浓度3次检测数据如表3，变异系数（CV%）为1.19%~6.27%，表明该方法稳定性良好。

图 4 多重实时荧光RPA法灵敏度

Figure 4 Sensitivity of multiple real-time fluorescence RPA method

注： a、b、c为扩增曲线图，模板分别为 ASFV、PDCoV、SVA质粒，1~4稀释度分别为10^-7~10^-10，5为阴性对照

表 3 多重实时荧光RPA法稳定性

Table 3 Stability of multiplex real-time fluorescence RPA method

病毒	稀释度	样品浓度/（copies/μL）	Ct值	平均数	标准偏差SD	变异系数CV/%
ASFV	10^-7	9.4×10³	13.38	13.03	0.42	3.26
			12.56
			13.16
	10^-8	9.4×10²	26.69	24.89	1.56	6.27
			23.86
			24.13
PDCoV	10^-7	7.7×10³	26.28	26.37	0.63	2.39
			25.79
			27.04
	10^-8	7.7×10²	36.26	37.17	1.19	3.19
			38.51
			36.74
SVA	10^-7	5.7×10³	19.30	19.16	0.23	1.19
			19.02
			18.85
	10^-8	5.7×10²	24.43	25.58	1.02	3.97
			25.94
			26.36

2.6 实际样品检测

对实验室保存的实际样本及核酸样本，设立阳性、阴性对照，分别进行荧光PCR、实验室前期建立的单重实时荧光RPA和本实验所建立多重荧光RPA检测，以检验本方法的试验效果。检测结果阳性对照和阴性对照均正常，实时荧光PCR与单重实时荧光RPA结果一致，6份核酸样本检测结果为ASFV核酸阳性，所有样品均未检出PDCoV、SVA；而多重实时荧光RPA检测仅4份核酸样本呈ASFV阳性，所有样品均未检出SVA及PDCoV。多重实时荧光RPA检测ASFV、PDCoV、SVA准确率分别为93.33%、100%、100%，见表4。

表 4 样本检测结果

Table 4 Test results of samples

样品	ASFV			PDCoV			SVA
样品	WOAH推荐荧光PCR	单重实时荧光RPA	多重实时荧光RPA	行业标准荧光PCR	单重实时荧光RPA	多重实时荧光RPA	参考文献荧光PCR	单重实时荧光RPA	多重实时荧光RPA
猪肉或其制品(1-24)	-	-	-	-	-	-	-	-	-
核酸样本1	Ct值：35.79	+	-	-	-	-	-	-	-
核酸样本2	Ct值：30.66	+	-	-	-	-	-	-	-
核酸样本3	Ct值：20.19	+	+	-	-	-	-	-	-
核酸样本4	Ct值：19.31	+	+	-	-	-	-	-	-
核酸样本5	Ct值：23.23	+	+	-	-	-	-	-	-
核酸样本6	Ct值：22.10	+	+	-	-	-	-	-	-
阳性率	20%(6/30)	20%(6/30)	13.33%(4/30)	—	—	—	—	—	—

注： +为阳性，-为阴性；WOAH手册规定Ct值≤38.0，则判定被检样品ASFV阳性

3 讨论

本研究建立了猪肉及其制品中ASFV、PDCoV、SVA的多重实时荧光RPA检测方法，基于系列预实验，将反应体系中的引物探针初始添加量设置为1.5、0.5 µL，在此基础上确定最佳反应时间；温度是影响实验扩增速率的重要因素，直接关系到酶活性^［

21］，进行温度优化实验，最终确定为39 ℃，低于该反应温度，多重实时荧光RPA反应的荧光强度及反应速率均会下降，高于该反应温度则会发生二次扩增反应，有出现假阴性的可能。实验室前期已分别针对ASFV、PDCoV、SVA建立实时荧光RPA，其灵敏度较高，分别为94、77、57 copies/µL，而多重实时荧光RPA由于引物探针添加量减少、不同引物探针之间相互影响等因素，检出限较高，应用于核酸样本检测时，多重RPA反应未检出的两份阳性核酸样本Ct值均大于30，可能是由于样本浓度较低，低于该方法检测范围，出现假阴性现象，准确率不能达到100%，与杨洋^{［参考文献 22

百度学术}22］针对PCV2、PRV及PPV所建立的Multiplex real-time RPA实验结果相似，3种病毒灵敏度均大于1 000 copies/µL，疑似样品检出率平均为88%。同样由王凤娇等^{［参考文献 23

百度学术}23］建立的食品中沙门菌、单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽胞杆菌多重RPA快速检测方法的灵敏度（最低为1.44×10⁴ CFU/mL），与荧光RPA灵敏度差异较大。此外，LI等^{［参考文献 24

百度学术}24］所建立的双重RT-RPA检测方法，用于猪流行腹泻病毒和PDCoV的灵敏度为1×10² copies/µL，检测目标减少，灵敏度有所提高。多重实时荧光RPA反应能同时扩增多种目标基因，其体系的配置并不是多种单重实时荧光RPA反应体系的简单相加，体系中寡核苷酸总量过多会导致底物被大量非特异性扩增耗尽，而引物浓度过低，造成反应时间过长，长时间的反应意味着非特异性扩增发生概率增大^{［参考文献 25

百度学术}25］，同时，不同引物竞争重组蛋白，不同反应之间存在相互抑制的可能性^{［参考文献 23

百度学术}23］。

试验结果表明，多重实时荧光RPA检测方法具备良好的特异性，与其他常见猪病病毒未产生交叉反应，且实现同时检测ASFV、PDCoV、SVA，在现场快速检测上具有一定优势，设备简单易推广，适用于食品加工企业、生猪养殖企业对于生鲜猪肉及其制品中的ASFV、PDCoV、SVA检测，有效防范病害生猪及产品流入市场，也可用于海关口岸检疫及市场监管快检中低成本大规模初筛，为外来疫病防控、食品安全监管提供了重要的技术支撑。

该方法存在局限性问题待进一步研究优化，例如灵敏度低无法实现对低浓度污染样本的检测，是制约其发展的重要因素，是未来此类方法的探究建立时应着重解决的问题。引物探针的设计是RPA方法的关键点，如需进行高灵敏度的实验分析，必须进行大量引物探针筛选研究^［

26］，本实验根据每种病毒的靶序列设计了5对引物，不足以满足高灵敏度的筛选要求，可多加设计以供选择；此外，建立多重RPA方法时不应限于同一目标序列引物的互筛，另需进行不同靶序列引物之间的筛选，以降低其发生抑制反应的可能性，并在此基础上进行条件优化。RPA反应主要依靠酶催化及MgOAc促发，尤其应考虑MgOAc添加量对反应造成的影响，因其低添加量在实验过程中易产生系统误差，影响实验结果，操作人员须谨慎。此外，本实验以质粒为对象进行研究，PDCoV、SVA为RNA病毒，因此在进行RPA扩增前对实际样本需先进行反转录，较一步法扩增操作复杂化、耗时长，加大RNA降解可能性，存在交叉污染风险。另一方面，将RPA或其产物与生物传感器、测流流动试纸条、CRISPR-Cas、微控流芯片等技术手段相结合集成化^{［参考文献 27-30}27-30］，在快速检测的同时保证灵敏度及准确性，实现结果可视化、定量化，有助于服务特定情景，对于病原体前期防控意义重大，有利于切断传播途径，保障食品质量安全。

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