摘要
224株食源性金黄色葡萄球菌对12类抗菌药物的整体耐药率为87.9%(197/224),对青霉素的耐药率最高为82.6%(185/224)。多重耐药率为23.2%(52/224),多重耐药菌中ST398占比最高为26.9%(14/52),耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检出率为8.0%(18/224)。葡萄球菌肠毒素基因整体携带率为52.2%(117/224),其中sea的携带率最高为24.6%(55/224),携带肠毒素基因种类最多的ST型为ST1。共检测到31种ST型,其中ST7最多(12.9%,29/224),ST398次之(10.7%,24/224)。中毒性休克综合征毒素编码基因(tsst-1)和杀白细胞素编码基因(lukF-PV和lukS-PV)的携带率分别为6.3%(14/224)和4.5%(10/224)。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S. aureus)产生的肠毒素(Staphylococcal enterotoxins, SEs)会导致食源性疾病,引发呕吐、腹泻、腹痛、头痛、肌肉痉挛等急性胃肠炎症状,潜伏期较短,约4.4 h,被世界卫生组织(World Health Organization,WHO)列为四大食源性致病菌之一。在美国,每年由金黄色葡萄球菌引起食源性疾病预计为24万
此外,金黄色葡萄球菌是一种常见的条件致病菌,可在人体皮肤和呼吸道定植,大约30%的健康人群是金黄色葡萄球菌的携带者,金黄色葡萄球菌也是导致人类皮肤及软组织感染、心内膜炎、植入医疗设备相关感染甚至菌血症、脓毒症等全身感染的重要致病
本研究对食品中分离的224株金黄色葡萄球菌进行耐药及遗传特征分析,探讨了我国食源性金黄色葡萄球菌的流行特征,这将为合理评估金黄色葡萄球菌导致的食品安全风险提供数据支撑。
实验用224株金黄色葡萄球菌均来自2020年国家食品污染物监测网,分离自全国24省(自治区、直辖市)的食品样品。样品种类包括生肉、熟肉制品、餐饮食品、现制饮品、糕点、乳与乳制品、藻类和调味品。药物敏感性试验中使用的质控菌株为金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213。
Pall-Cascada纯水仪(美国颇尔公司);HVA-85高压蒸汽灭菌锅(日本平山制作所);Esco class Ⅱ BSC二级生物安全柜(新加坡艺思高科技有限公司);IKA MS3涡旋仪(德国IKA集团);Incucell隔水式恒温培养箱(德国MMM集团);MK-10干式加热型恒温器(杭州奥盛仪器有限公司);Sigma1-14小型离心机(德国Sigma公司);NanoDrop-2000微量分光光度计(美国赛默飞世尔科技公司)。
脑心浸液琼脂培养基(Brain heart infusion agar,BHIA)、脑心浸液肉汤培养基(Brain heart infusion broth,BHI)(北京陆桥技术股份有限公司);金黄色葡萄球菌药敏测试板(上海星佰生物技术有限公司);细菌DNA提取试剂盒(美国Omega公司)。
根据国标GB 4789.10—2016对224株菌进行复核鉴定,鉴定无误菌株使用20%甘油管-80 ℃冻存。菌株活化时,取出冻存保菌管,待融化后接种环蘸取菌液接种于BHIA上,(36±1) ℃培养18~24 h进行复苏,挑取单菌落再次接种BHIA,相同条件下进行二次活化,活化菌株用于后续实验。
参照美国临床和实验标准委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的微量肉汤稀释法对菌株进行药物敏感性试验,共检测菌株对12类(13种)抗菌药物的耐药性。抗菌药物包括:头孢西丁(Cefoxitin,CFX)、苯唑西林(Oxacillin,OXA)、青霉素(Penicillin,PEN)、四环素(Tetracycline,TET)、红霉素(Erythromycin,ERY)、克林霉素(Clindamycin,CLI)、氯霉素(Chloramphenicol,CHL)、环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、庆大霉素(Gentamicin,GEN)、复方新诺明(Trimethoprim-sulfamethoxazole,SXT)、利奈唑胺(Linezolid,LZD)、达托霉素(Daptomycin,DAP)和万古霉素(Vancomycin,VAN)。药敏试验的结果判读参照CLSI M100 ED29—2019。
挑取单菌落接种于BHI肉汤培养基,(36±1) ℃培养18~24 h,涡旋混匀并吸取菌悬液1 mL于1.5 mL离心管中,4 000×g离心10 min弃上清并保留沉淀并入1 mL无菌生理盐水重悬菌体,4 000×g离心10 min,弃上清保留管底菌体,参照细菌DNA提取试剂盒说明书完成后续操作。使用Nanodrop微量分光光度计对提取DNA的浓度及质量进行质控检测。检测合格后送样至上海美吉生物医药科技有限公司进行细菌全基因组测序(Whole genome sequencing,WGS),测序平台为Illumina NovaSeq6000,测序深度大于100×,使用Trimmomatic v0.39去除下机数据接头及低质量碱基序列;使用fastp version 0.20.0对原始数据进行质量剪切,去除低质量reads,使用软件SOAPdenovo2进行序列拼接得到最优结果,并使用QUAST v4.5进行评估。基因组的完整性和是否存在污染通过checkM v1.1.6进行评估,选择完整性>98%,无污染的数据并使用Prokka v1.14.5对基因组进行注释。
多位点序列分型(Multilocus sequence typing, MLST)是将获得的基因序列上传至金黄色葡萄球菌多位点序列分析平台pubMLST(https://pubmlst.org/organisms/staphylococcus-aureus)分析,根据7个管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqiL)编号获得对应ST型别。
金黄色葡萄球菌的甲氧西林耐药性主要由mecA基因(编码PBP2a)或mecC基因(编码PBP2c)介导,将基因序列与数据库ResFinder v2.1进行比对,检测上述基因。此外,可根据CLSI中推荐的通过检测菌株对β内酰胺类抗生素头孢西丁和苯唑西林的耐药情况对MRSA菌株进行判断。
224株食源性金黄色葡萄球菌对13种抗菌药物的药物敏感性试验结果显示,有197株至少对1种抗菌药物耐药,只有27株对所有抗菌药物均表现为敏感,总耐药率为87.9%(197/224)。其中,菌株对青霉素的耐药率最高为82.6%(185/224),对红霉素、四环素、克林霉素及环丙沙星的耐药率依次为38.8%(87/224)、17.0%(38/224)、15.2%(34/224)及11.6%(26/224)。对苯唑西林、头孢西丁、庆大霉素、氯霉素、复方新诺明的耐药率均在10.0%以内,没有检测到对利奈唑胺、达托霉素、万古霉素耐药的菌株。此外,23.2%(52/224)的菌株存在红霉素诱导的克林霉素耐药,详见
图 1 224株金黄色葡萄球菌对13种抗菌药物的耐药率
Figure 1 Resistance rate of 224 S. aureus isolates to 13 kinds of antimicrobials
在197株耐药菌株中,共检测到29种耐药谱,其中仅耐受1类抗菌药物的菌株最多占44.2%(99/224),耐受2类、3类、4类及5类及以上药物的菌株分别占20.5%(46/224)、8.9%(20/224)、6.7%(15/224)及7.6%(17/224)。耐受3类或以上抗菌药物的MDR菌株占总数的23.2%(52/224),且MDR在生肉中的检出率较高为31.6%,其中检出率最高的食品类别主要有生牛肉、肉酱、生猪肉及内脏和生鸭肉,且来自于生肉的菌株耐受5类及以上抗菌药物的比例更高,为19.7%(15/76)。有3株菌最高能耐受8类抗菌药物,耐药谱分别为PEN-ERY-CLI-CIP-SXT-TET-CHL-GEN(2株)和PEN-OXA-ERY-CLI-CIP-SXT-TET-GEN-CFX(1株),样品类别依次为生鸭肉、草莓西米露和生鸡肉。
对224株菌进行MLST分子分型,结果显示共有31个ST型,其中ST7最多(12.9%,29/224),其次为ST398(10.7%,24/224),ST1、ST188、ST5、ST6均占7.1%(16/224),之后依次为ST15、ST2990、ST88、ST22、ST25、ST965、ST1281、ST2114、ST464、ST59、ST45、ST522、ST12、ST573、ST72、ST9、ST97、ST121、ST243、ST4562、ST508、ST630、ST758、ST944和ST950。生肉中金黄色葡萄球菌的主要ST型为ST398(23.7%,18/76)和ST7(17.1%,13/76),而即食食品中金黄色葡萄球菌的主要ST型则为ST188和ST7(10.8%,16/148)。52株MDR中ST398型占比最高为26.9%(14/52),耐受5类及以上抗菌药物菌株中ST398型占76.5%(13/17),之后是ST9(11.8%,2/17)、ST5和ST25(5.9%,1/17)。
根据耐药表型和全基因组序列分析mecA基因携带情况综合判定,两种方法判定结果一致,即共有18株为MRSA菌株,检出率为8.0%(18/224)。从食品类别来看,MRSA菌株主要来自即食食品/饮品,检出率为11.5%(17/148),检出率较高的食品类别依次为藻类(30.0%,3/10)、糕点(19.0%,4/21)、现制饮品(12.5%,6/48)等。其中,MRSA菌株的主要ST型为ST1(22.2%,4/18)、ST59(16.7%,3/18)和ST398(11.1%,2/18)。有2株MRSA能耐受7类及以上类的抗菌药物,分别为ST9和ST398型,分离自鸡肉和现制饮品。
根据VFDB毒力因子数据库的基因注释结果,共检测到8种肠毒素基因,分别为sea、seb、sec、sed、seh、selk、sell和selq。携带至少1种肠毒素基因菌株占比为52.2%(117/224),其中sea的携带率最高为24.6%(55/224),其余依次为sec和sell(16.1%,36/224)、selk和selq(9.4%,21/224)、seb(8.5%,19/224)、seh(7.6%,17/224)、sed(4.0%,9/224)。共检测到肠毒素基因谱18种(
序号 | 携带肠毒素基因数 | 肠毒素基因谱 | ST型 | 菌株数 | 占比/% |
---|---|---|---|---|---|
1 | 6 | sea-sec-seh-selk-sell-selq | ST1 | 4 | 1.8 |
2 | 5 | sea-seb-seh-selk-selq | ST1 | 1 | 0.4 |
3 | 5 | sec-seh-selk-sell-selq | ST1 | 3 | 1.3 |
4 | 4 | sea-seb-selk-selq | ST59 | 1 | 0.4 |
5 | 4 | sec-selk-sell-selq | ST508 | 1 | 0.4 |
6 | 3 | sea-sec-sell | ST7 | 4 | 1.8 |
7 | 3 | seb-selk-selq | ST59 | 3 | 1.3 |
8 | 3 | sec-sed-sell | ST5 | 1 | 0.4 |
9 | 3 | sec-seh-sell | ST1 | 1 | 0.4 |
10 | 3 | seh-selk-selq | ST1 | 4 | 1.8 |
11 | 2 | sea-sed | N/A | 1 | 0.4 |
12 | 2 | seb-seh | ST1 | 2 | 0.9 |
13 | 2 | sec-sell | ST2990、ST522、ST12、ST188、ST45、ST573、ST5、ST72 | 22 | 9.8 |
14 | 2 | selk-selq | ST464 | 4 | 1.8 |
15 | 1 | sea | ST7、ST6、ST88、ST5、N/A | 44 | 19.6 |
16 | 1 | seb | ST25、ST15、ST188、N/A | 12 | 5.4 |
17 | 1 | sed | ST5 | 7 | 3.1 |
18 | 1 | seh | ST1 | 2 | 0.9 |
19 | 0 | — | ST398、ST188、ST15、ST22、ST7、ST965、ST1281、ST6、ST2114、ST5、ST25、ST9、ST97、ST121、ST243、ST45、ST4562、ST630、ST72、ST758、ST88、ST950、N/A | 107 | 47.8 |
MRSA菌株中肠毒素基因的携带率为61.1%(11/18),MDR菌株中肠毒素基因携带率为53.8%(28/52)均与整体携带率52.2%接近。携带肠毒素基因的菌株中以ST7(19.7%,23/117)、ST1(13.7%,16/117)、ST5(10.3%,12/117)、ST6(9.4%,11/117)较多,其中16株ST1型金黄色葡萄球菌均携带肠毒素基因,且携带肠毒素种类最多,同时携带5种及以上肠毒素基因的菌株均属于ST1型,肠毒素基因谱与ST型关系详见
此外,中毒性休克综合征毒素TSST-1的编码基因tsst-1的携带率为6.3%(14/224);杀白细胞素PVL由两个亚单位组成,编码基因分别为lukF-PV和lukS-PV,同时携带上述两个基因的菌株占4.5%(10/224)。携带tsst-1基因的菌株以ST7(28.6%,4/14)、ST1和ST522(均21.4%,3/14)为主,其中有的3株ST1型菌株既是MRSA又是MDR,携带tsst-1和5种肠毒素基因(sec-seh-selk-sell-selq)。同时携带lukF-PV和lukS-PV基因的菌株则主要为ST22型(40.0%,4/10)。
2017年WHO将金黄色葡萄球菌列入对人类健康构成重大威胁细菌,属于最优先关注等级的ESKAPE(屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属细菌)之一,这是一类与严重感染相关且耐药情况严重的细
目前已发现20余种肠毒素及肠毒素样毒素,其中经典肠毒素仍是导致葡萄球菌食物中毒的主要类
综上,通过对我国24省(直辖市/自治区)食源性金黄色葡萄球菌的耐药性、毒力因子以及分子分型的检测分析,为更好地了解我国食品中金黄色葡萄球菌流行特征并制定相应的监测和防控策略提供科学的数据支撑。
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