摘要
利用K-B法进行产ESBL菌表型确证试验；通过聚合酶链式反应方法，对产超广谱β-内酰胺酶沙门菌相关耐药基因（blaTEM、blaSHV、blaCTX）以及可移动元件—整合子基因进行扩增，对整合子可变区扩增产物进行基因测序，分析携带耐药基因盒。
共分离309株沙门菌，138株来自食品（禽类96株，生猪肉19株，水产品23株），171株来自临床样本。309株沙门菌耐药率达78.3%，多重耐药率达41.1%，其中禽类耐药率占比最高。共检出56株产ESBL菌，其中35株携带产ESBL菌相关耐药基因（blaTEM基因型15株，blaCTX基因型10株，blaTEM与blaCTX双基因型10株），未检出blaSHV基因。检出98株I类整合子阳性菌，阳性率为31.7%。其中54株携带耐药基因盒，47株携带dfrA以及aadA基因，1株携带linG-aadA22基因盒，其余为空基因盒。整合子阳性菌和产ESBL菌多重耐药率分别高达98.0%和89.3%。产ESBL菌中整合子阳性率高达76.8%（43/56）。
沙门菌广泛存在于自然界中，属于食源性致病菌，易造成禽畜类、蛋类、生畜肉类及其制品
近年来，第三、四代头孢菌素的广泛使用以及临床不规范用药，使得越来越多的产超广谱β-内酰胺酶类（Extended-spectrum β-lactamase，ESBL）耐药菌株被发现，给临床治疗及其用药带来巨大的挑战。该基因属于质粒介导，基因型主要包括blaTEM、blaSHV、blaCTX等，不同地区沙门菌基因型各不相
本研究通过调查辽宁省生猪肉、家禽、水产品中沙门菌中产ESBL菌基因型以及整合子分布，并与该地区食物中毒患者临床样本中分离的沙门菌进行对比，探究不同来源沙门菌在整合子、ESBL基因型分布，为指导临床合理用药，深入研究多重耐药机制提供数据支持。
VITEK Ⅱ全自动生化鉴定仪（法国梅里埃），全自动凝胶成像系统、PCR仪（Bio-RAD）。
缓冲蛋白胨水（Buffered peptone water，BPW）、四硫磺酸钠煌绿增菌液（Tetrathionate broth base，TTB）、亚硒酸盐胱氨酸（Selenite cystine broth，SC）购自北京陆桥，沙门菌显色培养基（法国科马嘉），磺胺增菌液（Sulfonamide enrichment solution，SBG）、Mueller-Hinton琼脂（MH）购自青岛海博，革兰氏阴性需氧菌药敏检测板（上海星佰）；药敏纸片（英国Oxoid）；VITEK生化鉴定板（法国梅里埃）；2×premix（Promega）。
连续监测2017—2021年辽宁省市售生猪肉类、家禽类、水产品等食品。按照GB 4789.4—2016检测方法，取上述样本25 g，加入到225 mL BPW中，36 ℃培养18 h。取1 mL增菌液分别加入10 mL TTB和10 mL SC中。待36 ℃培养24 h后，接种至科玛嘉沙门显色平板，36 ℃培养24 h后挑取可疑菌落进行生化鉴定。取本地区疑似沙门菌引起的食源性中毒的腹泻患者粪便样本，接种于SBG増菌液中，36 ℃培养24 h后接种于科玛嘉沙门显色平板，36 ℃培养24 h，对可疑菌落进行生化鉴定。
挑取少量菌体制成1.5×1
参照CLSI筛选判定标准，利用Kirby-Bauer方法，分别测定沙门菌在MH培养基上头孢噻肟、头孢他啶、头孢噻肟/克拉维酸、头孢他啶/克拉维酸的抑菌环直径长度，若头孢噻肟或头孢他啶其中任意一种药物与克拉维酸联合用药后抑菌环直径长度差>5 mm，则判定为产ESBL表型阳性。
煮沸法提取沙门菌DNA。整合子以及ESBL相关基因引物，详细序列见
| 目标基因 | 引物序列(5’→3’) | 碱基长度/bp |
|---|---|---|
| Ⅰ类整合子 |
F：GATGCGTGGAGACCGAAACCTT R：TAACGCGCTTGCTGCTTGGATGC | 303 |
| Ⅱ类整合子 |
F：GTGCAACGCATTTTGCA R：CAACGGACATGCAGATG | 403 |
| Ⅲ类整合子 |
F：CATTTGTGTTGTGGACGGC R：GACACATACGTGTTTGGCAA | 717 |
| Ⅰ类整合子可变区 |
F: GGCATCCAAGCAGCAAGC R：AAGCAGACTTGACCTGAT | 长度可变 |
| blaTEM |
F：TCGGGGAAATGTGCG R：TGCTTAATCAGTGAGGCACC | 972 |
| blaSHV |
F：GCCTTTATCGGCCTTCACTAAG R：TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA | 898 |
| blaCTX-M |
F：ACGCTTTCCAATGTGCAGTA R：ACGTCACCAATGCGCGCCC | 436 |
| 目的基因 | 预变性/(℃/s) | 变性/(℃/s) | 退火/(℃/s) | 延伸/(℃/s) | 终延伸/(℃/s) | 循环次数 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 整合子 | 94/300 | 94/30 | 58/30 | 72/30 | 72/600 | 30 |
| 可变区 | 94/300 | 94/60 | 56/45 | 68/300 | 72/600 | 30 |
| 产ESBL相关基因 | 94/300 | 94/60 | 58/45 | 68/300 | 72/600 | 30 |
自2017—2021年共从市售商品中分离出138株沙门菌，其中96株来自禽类，19株来自生猪肉，23株来自水产品。从临床样本中共分离171株沙门菌。309株沙门菌中共有56株产ESBL表型阳性菌，阳性率为18.1%，与其他食源性致病菌相比略
图1 不同来源沙门菌整合子与产ESBL菌阳性率
Figure 1 Integron and ESBL-producing positive rate of Salmonella from different sources
309株沙门菌中共检出98株Ⅰ类整合子阳性菌，阳性率为31.7%，未检出Ⅱ、Ⅲ类整合子。经PCR整合子可变区扩增，发现其中54株携带耐药基因盒，核酸片段从150 bp到1 800 bp不等。将PCR扩增产物回收后进行测序。其中，6株沙门菌的150 bp片段为空基因盒。其余48株携带3种基因盒：43株携带耐药基因盒dfrA17-aadA5，4株携带耐药基因盒dfrA12-aadA2，1株携带耐药基因盒linG-aadA22，dfr是二氢叶酸还原酶基因、aad是核苷酸转移酶基因。此外，整合子携带的基因盒中发现有较为罕见的linG-aadA22。linG是林可胺类抗生素耐药基因，此类抗生素主要用于革兰氏阳性细菌的治疗，虽然linG整合子基因盒对沙门菌本身的生长并无影响，但仍可以通过整合子水平传播到其他革兰氏阳性细菌中，给其他细菌引起的疾病治疗产生影响。从不同来源沙门菌整合子携带情况分析，家禽类食品中分离出的沙门菌其整合子占比最高，为40.6%（39/96）；其次为临床样本来源，为30.4%（52/171）。生猪肉与水产品整合子携带率分别为17.4%和15.8%。
309株沙门菌耐药率为78.3%（242/309），其中家禽类最高，达82.3%（79/96），其他依次为临床样本80.1%（137/171）、生猪肉73.7%（14/19）、水产品52.2%（12/23）。耐三类或更多类抗生素为多重耐药，309株沙门菌多重耐药达41.1%（127/309），家禽类52.1%（50/96）、临床样本38.6%（66/171）、水产品30.4%（7/23）、生猪肉21.1%（4/19）。由
| 抗生素 | 不同来源沙门菌 | 合计(n=309) | |||
|---|---|---|---|---|---|
| 临床样本(n=171) | 家禽(n=96) | 生猪肉(n=19) | 水产品(n=23) | ||
| CIP | 20（11.7） | 29(30.2) | 0(0) | 5(21.7) | 54(17.5) |
| CHL | 30（17.5） | 28(29.2) | 3(15.8) | 6(26.1) | 67(21.7) |
| NAL | 86（50.3） | 70(72.9) | 6(31.6) | 8(34.8) | 170(55.0) |
| GEN | 27（15.8） | 16(16.7) | 0(0) | 4(17.4) | 47(15.2) |
| TET | 78（45.6） | 43(44.8) | 9(47.4) | 8(34.8) | 139(44.7) |
| CTX | 22（12.8） | 25(26.0) | 0(0) | 3(13.0) | 50(16.2) |
| CFX | 0（0） | 0(0) | 0(0) | 3(13.0) | 3(1.0) |
| AMP | 106(62.0) | 62(64.6) | 8(42.1) | 9(39.1) | 185(59.9) |
| AMS | 61（35.7） | 34(35.4) | 2(10.5) | 3(13.0) | 100(32.4) |
| CAZ | 6（3.5） | 17(17.7) | 0(0) | 2(8.7) | 25(8.1) |
| CFZ | 55（32.2） | 36(37.5) | 1(5.3) | 5(21.7) | 97(31.4) |
| IPM | 0（0） | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) |
| AZM | 11（6.4） | 11(11.5) | 0(0) | 2(8.7) | 24(7.8) |
| SXT | 56（29.8） | 28(29.2) | 3(15.8) | 5(21.7) | 87(28.2) |
| AMR | 137（80.1） | 80(82.3) | 14(73.7) | 12(52.2) | 242(78.3) |
| MDR | 66（38.6） | 50(52.1) | 4(21.1) | 7(30.4) | 127(41.1) |
注： 四种来源中耐药率最高者数值加粗
比对整合子与产ESBL菌对抗生素耐药率的影响，从
| 抗生素 | 整合子 | ESBL | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 阳性(n=98) | 阴性(n=211) | P | 阳性(n=56) | 阴性(n=253) | P | |
| CIP | 50(51.0) | 4(1.9) | <0.01 | 29(51.8) | 25(9.9) | <0.01 |
| CHL | 38(38.8) | 29(13.7) | <0.01 | 33(58.9) | 34(13.4) | <0.01 |
| NAL | 70(71.4) | 100(47.4) | <0.01 | 40(71.4) | 130(51.4) | <0.01 |
| GEN | 43(43.9) | 4(1.9) | <0.01 | 29(51.8) | 18(7.1) | <0.01 |
| TET | 85(86.7) | 53(25.1) | <0.01 | 45(80.4) | 93(36.8) | <0.01 |
| CTX | 37(37.8) | 13(6.2) | <0.01 | 29(87.5) | 1(0.4) | <0.01 |
| CFX | 0(0) | 3(1.4) | >0.01 | 0(0) | 3(1.2) | >0.01 |
| AM | 94(95.9) | 91(43.1) | <0.01 | 56(100) | 129(51.0) | <0.01 |
| AMS | 53(54.1) | 47(22.3) | <0.01 | 29(51.8) | 71(28.1) | <0.01 |
| CAZ | 16(16.3) | 9(4.3) | <0.01 | 23(41.1) | 2(0.9) | <0.01 |
| CFZ | 56(57.1) | 41(19.4) | <0.01 | 49(87.5) | 48(19.0) | <0.01 |
| IMP | 0(0) | 0(0) | — | 0(0) | 0(0) | — |
| AZM | 23(23.5) | 1(0.5) | <0.01 | 10(17.9) | 14(5.5) | <0.01 |
| SXT | 80(81.6) | 7(3.3) | <0.01 | 28(50.0) | 59(23.3) | <0.01 |
| AMR | 98(100) | 144(68.2) | <0.01 | 56(100) | 186(73.5) | <0.01 |
| MDR | 96(98.0) | 31(14.7) | <0.01 | 50(89.3) | 77(30.4) | <0.01 |
整合子中检出的基因盒中大部分携带dfr和aad基因，二者分别是磺胺类药物与氨基糖苷类药物的耐药基因。由
本研究结果表明，不同来源沙门菌耐药率有所差异。无论是总体耐药率还是多重耐药率，禽类来源的沙门菌的耐药率均居4种来源之首，分别高达82.3%和52.1%。不同来源（临床、生猪肉、家禽及水产品）的沙门菌均对第一代喹诺酮类抗生素NAL和第一代β-内酰胺类抗生素AMP、AMS、CFZ产生较强的耐药性。除抗生素CFX和IMP以外，禽类来源沙门菌对其他12种抗生素耐药率均高于平均耐药率，这与本地区禽类养殖过程中养殖环境过于密集，养殖饲料中抗生素滥用问题密切相关，故应在禽类养殖过程中规范抗生素的使用并加强监管。对于产ESBL沙门菌，则对CFX和IMP较为敏感，这两种抗生素可以作为产ESBL菌感染的临床治疗用药，此研究结果与国外临床治疗ESBL菌引起的疾病方法相一
此次56株产ESBL菌共检出3种基因型，即blaTEM、blaCTX及二者兼并型，占比分别为26.8%、17.9%、17.9%，说明本地区基因型为此3种基因型，合计占比达到62.5%。与国内其他地区相比，blaTEM与blaCTX占比较
56株产ESBL阳性菌中整合子阳性者达43株（76.8%），整合子阴性者仅13株（23.2%）。由此可见，在产ESBL菌中整合子分布非常广泛，此结果与徐令清
综上所述，辽宁地区沙门菌中整合子与产ESBL菌分布广泛，耐药形势严峻。整合子与产ESBL菌可能存在相关性，对于细菌的多重耐药菌均有重要影响。临床治疗中，产ESBL菌可以选择IMP和CFX，无论在临床还是养殖行业，均应加强监管，合理使用抗生素。
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