摘要
采集四川部分地区市场售卖点肉鸡直肠拭子，用含有多黏菌素（终浓度4 µg/mL）的EC肉汤增菌接种含多黏菌素（终浓度4 µg/mL）的麦康凯平板，挑取可疑菌落，采用PCR方法鉴定菌株并检测mcr-1基因；微量肉汤稀释法测定mcr-1基因阳性菌株对临床常见抗菌药物耐药情况。脉冲场凝胶电泳（PFGE）对mcr-1基因阳性菌株进行同源分析。耐药基因质粒结合实验验证mcr-1基因传播途径。
从70份肉鸡样本中的13份检出mcr-1基因阳性大肠埃希氏菌，检出率18.57%（13/70），对实验的13种抗生素，除13株mcr-1阳性菌株对头孢西丁有12株敏感以外，对其他抗生素都表现出不同程度的耐药，其中四环素和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑耐药率最高，达到了100%（13/13）；其次是氨苄西林和氯霉素，耐药率为84.62%（11/13）。PFGE显示13株mcr-1阳性大肠埃希氏菌分属13个不同的型别；质粒结合实验显示mcr-1基因能够通过质粒传播。
由于抗菌药物的广泛与不合理使用，细菌耐药问题日趋严峻。全球范围内，每年因耐药菌感染所致的死亡病例人数达70万，预估2050年可能会达到1 000万
为了解禁止使用多黏菌素作为促进剂后四川地区鸡源大肠杆菌mcr-1基因携带情况，本研究对肉鸡直肠内携带mcr-1基因大肠杆菌进行了检测，并对携带mcr-1菌株进行了药敏分析、脉冲场凝胶电泳（Pulse field gel electrophoresis，PFGE）同源分析和耐药基因质粒结合试验。
PCR仪（法国梅里埃），毛细管电泳仪（美国凯杰），脉冲场电泳仪、凝胶成像系统（美国伯乐公司），缓冲蛋白胨水、麦康凯（北京陆桥），ESBLs平板（法国科玛嘉），血琼脂平板（郑州安图），SeaKemGold琼脂糖（LONZA），10×TBE缓冲液（北京Solarbio），SDS、蛋白酶K、限制性内切酶XbaⅠ、Tris-HCl、EDTA、MH肉汤、药敏检测板（上海星柏）。
剖开肉鸡直肠，用一只棉签蘸取粪便加入含4 µg/mL的多黏菌素EC肉汤增菌，36 ℃过夜培养，取增菌液一环划线在含4 µg/mL的多黏菌素的麦康凯平板接种划线，36 ℃过夜培养，每个平板上挑取2株红色菌落进行纯化和鉴定。
对挑取的可疑菌落采用PCR方法进行鉴定，引物序列为：上游：5’-ATGCCAGTCCAGCGTTTTTGC-3’，下游：5’-AAAGTGTGGGTCAATAATCAGGAAGTG-3’，产物大小为1 487 bp。PCR反应体系（20 µL），DNA模板2 µL，上下游引物各1 µL，2×mix 16 µL。反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环30次，再72 ℃延伸5 min。PCR产物用毛细管电泳进行分析。
对鉴定为大肠埃希氏菌的菌株运用，PCR方法检测mcr-1基因，所用引物按照文献设
对mcr-1阳性菌株运用微量肉汤稀释法方法进行14种抗生素的敏感性实验，包括氨苄西林(Ampicillin，AMP）、氨苄西林/舒巴坦（Ampicillin/Sulbactam，AMS）、头孢唑啉（Cefazolin，CFZ）、头孢噻肟（Cefotaxime，CTX）、头孢西丁（Cefoxitin，CFX）、头孢他啶（Ceftazidime，CAZ）、氯霉素（Chloramphenicol，CHL）、环丙沙星（Ciprofloxazole，CIP）、庆大霉素（Gentamicin，GEN)、亚胺培南（Imipenem，IPM）、萘啶酸（Nalidixic acid，NAL）、四环素（Tetracycline，TET）、甲氧苄啶/磺胺甲𫫇唑(Trimethoprim/Sulfamethoxazole，SXT)。用纯培养的细菌和5 mL去离子水配制0.5 McF菌悬液，吸取定量0.5 McF菌悬液到MH肉汤管中，用于药敏检测板接种，以ATCC 25922大肠埃希氏菌作为质控菌株，以CLSI-100进行判
参照美国疾控中心PulseNet中用于大肠埃希氏菌的PFGE标准方法进行操作，选用沙门菌H9812作为标准菌。在细胞悬浮液CSB中加入过夜培养细菌，调整菌液浓度至4.0~4.5 McF，取400 µL至1.5 mL离心管中，再加入20 µL蛋白酶K和1%Seakem Gold凝胶，凝固后加入裂解液和蛋白酶K裂解，随后用水和TE重复洗涤。胶块经XbaⅠ进行酶切后电泳，染色成像。图像转换后应用BioNumberic数据库软件处理，选择Dice相关系数和UPGMA进行聚类分
以13株阳性菌株为供体菌，本实验室内保存的具有叠氮钠抗性的E.coli J53为受体菌，该菌未携带mcr-1基因。方法参考文献［
分别将供体菌和受体菌E.coli J53划线于含200 µg/mL叠氮钠和2 µg/mL黏菌素的Luria-Bertani（LB）药板上，以及两种药的联合药板上观察生长情况，确保供体菌只在2 µg/mL黏菌素的LB药板上生长，受体菌只在200 µg/mL叠氮钠的LB药板上生长。
分别挑供体菌和受体菌单菌落接种于3 mL LB 肉汤，37 ℃摇床过夜培养。
分别取供、受体菌150 µL和200 µL于2 mL LB肉汤37 ℃摇床培养3 h后，将供、受体菌按1∶4的比例混合均匀，取100 µL滴于不含药的普通LB琼脂上37 ℃温箱过夜培养。刮取LB琼脂板适量的菌苔于500 µL生理盐水，并在含有2 µg/mL黏菌素和200 µg/mL叠氮钠的双药LB板上划线培养24 h，分别在普通麦康凯平板和联合双药LB板上划线过夜培养筛选J53接合子，再对接合子用PCR鉴定是否含有mcr-1基因。
从70份肉鸡中共检出13株携带mcr-1基因大肠埃希氏菌，检出率18.57%（13/70）。其中，从绵阳检出6株mcr-1基因大肠埃希氏菌，检出率最高，为42.86%（6/14）；其次是资阳，检出率为28.57%（2/7），见
| 地点 | 样本量 | 阳性样本数 | 分离率/% | 菌株编号 |
|---|---|---|---|---|
| 雅安 | 14 | 2 | 14.29 | 2019042D、2019039D |
| 德阳 | 14 | 2 | 14.29 | 2019048D、2019054D |
| 资阳 | 7 | 2 | 28.57 | 2019060D、2019064D |
| 眉山 | 14 | 1 | 7.14 | 2019080D |
| 绵阳 | 14 | 6 | 42.86 |
2019084D、2019098D、 2019087D、2019096D、 2019094D、2019099D |
| 成都 | 7 | 0 | 0 | |
| 合计 | 70 | 13 | 18.57 |
药敏结果显示，13株mcr-1阳性菌株有12株对头孢西丁敏感，对其他抗生素都表现出不同程度的耐药，见
| 抗生素种类 | 耐药（R） | 中介（I） | 敏感（S） | 耐药率/% |
|---|---|---|---|---|
| 氨苄西林（AMP） | 11 | 0 | 2 | 84.62 |
| 氨苄西林/舒巴坦（AMS） | 6 | 5 | 2 | 46.15 |
| 头孢唑啉（CFZ） | 8 | 3 | 2 | 61.54 |
| 头孢噻肟（CTX） | 8 | 0 | 5 | 61.54 |
| 头孢西丁（CFX） | 0 | 1 | 12 | 0.00 |
| 头孢他啶（CAZ） | 1 | 1 | 11 | 7.69 |
| 氯霉素（CHL） | 11 | 0 | 2 | 84.62 |
| 环丙沙星（CIP） | 7 | 1 | 5 | 53.85 |
| 庆大霉素（GEN） | 4 | 3 | 6 | 30.77 |
| 亚胺培南（IMP） | 1 | 0 | 12 | 7.69 |
| 萘啶酸（NAL） | 9 | 0 | 4 | 69.23 |
| 阿奇霉素 | 2 | 0 | 11 | 15.38 |
| 四环素（TET） | 13 | 0 | 0 | 100.00 |
| 甲氧苄啶/磺胺甲恶唑（SXT） | 13 | 0 | 0 | 100.00 |
图 1 mcr-1阳性菌株对常见抗生素耐药情况
Figure 1 the situation of the mcr-1 positive strains to common antibiotics
图 2 mcr-1阳性菌株多重耐药情况
Figure 2 multiple drug resistance in mcr-1 positive strains
13株阳性大肠埃希氏菌XbaⅠ酶切PFGE条带数目在13~21条，聚类分析显示13株菌株分属13个不同型别，未出现同源性高于85%的菌株（
图 3 mcr-1阳性菌株PFGE分型结果
Figure 3 PFGE typing results of mcr-1 positive strain
通过观察，麦康凯上菌落形态与J53形态一致，颜色都为桃红色并且都能在LB双药板上正常生长，判定为结合子。同时通过PCR对结合子进行mcr-1基因检测，13株均为阳性（
图 4 结合子mcr-1基因毛细管电泳仪检测
Figure 4 Detection of binding mcr-1 gene by capillary electrophoresis
20世纪50年代，为促进畜禽的生长和预防疾病，多黏菌素类药物被各国作为饲料添加剂应用于养殖
本文从70份鸡直肠样本中筛选出13份mcr-1阳性菌株，检出率18.57%，高于2008—2015年猪禽源大肠埃希氏菌中筛选的mcr-1阳性菌株检出率（15.74%
本研究中，13株mcr-1阳性菌株均对13种抗生素表现出不同程度的耐药性，且超过90%（12/13）表现出严重的多重耐药，耐药种类最高达11种抗生素。养殖过程中长期不合理使用抗生素产生了选择性压力，也导致了多重耐药的增高，多黏菌素作为抗生素的最后一道防线，降低耐药率和遏制其传播迫在眉睫。
PFGE是基于菌株的DNA指纹原理来明确菌株之间的关联、传染源和传播途径，目前已广泛用于分析不同来源菌株是否关联集中暴
耐多黏菌素的耐药基因多种且变异亚型多，这种多样性导致细菌适应外界抗生素压力，引起多黏菌素的耐药水平和传播能力的改变。由于mcr-1基因可以通过接合性质粒，在大肠埃希氏菌、沙门菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌等不同宿主之间广泛传
参考文献
易灵娴， 刘艺云， 吴仁杰， 等. 质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1研究进展［J］. 遗传， 2017， 39（2）： 110-126. [百度学术]
YI L X， LIU Y Y， WU R J， et al. Research progress on the plasmid-mediated colistin resistance gene mcr-1［J］. Hereditas， 2017， 39（2）： 110-126. [百度学术]
邵华斌， 艾地云， 杨峻， 等. 肉鸡沙门菌病的流行情况及防控对策［J］. 中国家禽， 2010， 32（12）： 51. [百度学术]
SHAO H B， （AI/YI） D Y， YANG J， et al. 肉鸡沙门菌病的流行情况及防控对策［J］. China Poultry， 2010， 32（12）： 51. [百度学术]
张纯萍， 宋立， 崔明全， 等. 我国鸡源沙门氏菌的血清型分布和对黏菌素耐药性的研究［J］. 中国兽药杂志， 2018， 52（1）： 13-18. [百度学术]
ZHANG C P， SONG L， CUI M Q， et al. Serotype distribution and antimicrobial susceptibility to colistin of Salmonella spp. from chicken in China［J］. Chinese Journal of Veterinary Drug， 2018， 52（1）： 13-18. [百度学术]
杨永亚， 刘志欢， 宋雪艳， 等. 携带mcr-1鸡源大肠杆菌耐药性及传播特性的初步分析［J］. 中国预防兽医学报， 2021， 43（7）： 706-710， 733. [百度学术]
YANG Y Y， LIU Z H， SONG X Y， et al. Preliminary study on the drug resistance and transmission characteristics of chicken-derived Escherichia coli carrying mcr-1［J］. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine， 2021， 43（7）： 706-710， 733. [百度学术]
LIU Y Y， WANG Y， WALSH T R， et al. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism mcr-1 in animals and human beings in China： A microbiological and molecular biological study［J］. The Lancet Infectious Diseases， 2016， 16（2）： 161-168. [百度学术]
HAMASUNA R， YASUDA M， ISHIKAWA K， et al. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing： eighteenth informational supplement M100-S182008 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing： eighteenth informational supplement M100-S182008， 2008［S］. 2008. [百度学术]
GAUTOM R K. Rapid pulsed-field gel electrophoresis protocol for typing of Escherichia coli O157： H7 and other gram-negative organisms in 1 day［J］. Journal of Clinical Microbiology， 1997， 35（11）： 2977-2980. [百度学术]
TENOVER F C， ARBEIT R D， GOERING R V， et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis： Criteria for bacterial strain typing［J］. Journal of Clinical Microbiology， 1995， 33（9）： 2233-2239. [百度学术]
王亮亮， 王倩倩， 朱莹莹， 等. mcr-1阳性类噬菌体质粒与F33： A-： B-质粒共整合形成的融合质粒的生物学特性分析［J］. 江西农业学报， 2021， 33（4）： 103-107. [百度学术]
WANG L L， WANG Q Q， ZHU Y Y， et al. Biological characteristics of co-integrated plasmid derived from mcr-1-positive-phage-like plasmid and F33：A-：B-plasmid［J］. Acta Agriculturae Jiangxi， 2021， 33（4）： 103-107. [百度学术]
KOCH-WESER J， SIDEL V W， FEDERMAN E B， et al. Adverse effects of sodium colistimethate. Manifestations and specific reaction rates during 317 courses of therapy［J］. Annals of Internal Medicine， 1970， 72（6）： 857-868. [百度学术]
NORD N M， HOEPRICH P D. Polymyxin b and colistin. A critical comparison［J］. The New England Journal of Medicine， 1964， 270： 1030-1035. [百度学术]
李振斌， 姜雯， 宋传周， 等. 猪禽源大肠埃希菌和沙门菌对黏菌素的耐药性及mcr-1耐药基因检测［J］. 动物医学进展， 2018， 39（12）： 20-26. [百度学术]
LI Z B， JIANG W， SONG C Z， et al. Colistin resistance status of Escherichia coli and salmonella from swine and poultry and detection of mcr-1 gene［J］. Progress in Veterinary Medicine， 2018， 39（12）： 20-26. [百度学术]
祝瑶. 动物源大肠杆菌多粘菌素耐药基因mcr-1的流行病学及传播机制研究［D］. 北京： 中国农业科学院， 2019. [百度学术]
ZHU Y. The study on epidemiology and dissemination mechanism of colistin resistance gene mcr-1 in Escherichia coli from animal origin［D］. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2019. [百度学术]
WANG Y， ZHANG R M， LI J Y， et al. Comprehensive resistome analysis reveals the prevalence of NDM and mcr-1 in Chinese poultry production［J］. Nature Microbiology， 2017， 2： 16260. [百度学术]
吕虹， 雷高鹏， 黄伟峰， 等. 2007—2016年四川省德尔卑沙门菌耐药与分子分型分析［J］. 中国食品卫生杂志， 2018， 30（6）： 570-576. [百度学术]
LYU H， LEI G P， HUANG W F， et al. Characteristics of drug resistance and molecular typing for Salmonella derby isolated in Sichuan province， 2007-2016［J］. Chinese Journal of Food Hygiene， 2018， 30（6）： 570-576. [百度学术]
