(1.国家食品安全风险评估中心 卫生部食品安全风险评估重点实验室,北京100021; 2.北京市疾病预防控制中心营养与食品卫生所 食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室, 北京100013; 3.四川省疾病预防控制中心,四川 成都610041; 4.河南省疾病预防控制中心,河南 郑州450016)
通信作者: 徐进男研究员研究方向为食源性致病菌检测E-mail:xujin@cfsa.net.cn
收稿日期: 2017-01-11
基金项目: 北京市自然科学基金(7154252);北京市优秀人才培养资助青年拔尖个人项目(2015000021223ZK35)
(1.Key Laboratory of Food Safety Risk Assessment of Ministry of Health,China National Center for Food Safety Risk Assessment,Beijing 100021,China;2.Institute for Nutrition and Food Hygiene, Beijing Key Laboratory of Diagnostic and Traceability Technologies for Food Poisoning, Beijing Center for Disease Prevention and Control,Beijing 100013,China;3.Center for Disease Control and Prevention of Sichuan Province,Sichuan Chengdu 610041,China;4.Center for Disease Control and Prevention of Henan Province,Henan Zhengzhou 450016,China)
2017-01-11
细菌对氟喹诺酮类药物耐药存在多种耐药机制,主要包括染色体基因突变和编码耐药基因的可移动质粒[1]。引起高浓度氟喹诺酮耐药机制最常见的为染色体编码耐喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance determining regions,QRDRs)发生一个或多个点突变。其次还有外膜蛋白(OmpF)改变或是外排泵(AcrAB-TolC)表达增加等都可以引起细菌对氟喹诺酮类药物或其他药物耐药。除此之外,可移动质粒编码介导喹诺酮耐药(plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)也在氟喹诺酮耐药中发挥重要作用,包括了Qnr决定子、Aac(6′)-Ib-cr、QepA和OqxAB等耐药元件,它们通过不同方式(结合药物靶点、外排泵)降低细菌对氟喹诺酮类抗生素的敏感性[1]。
我国关于耐环丙沙星大肠埃希菌报道多分离自肠道外感染病例(如血液、泌尿系统、腹腔等)[3],2014年发布的第一份全球耐药报告显示耐环丙沙星大肠埃希菌已成为重要的食源性致病菌,对人类产生巨大的健康风险和疾病负担[4]。特别是其具有复杂、可传播的喹诺酮耐药机制,引起全球科学家的关注。本研究针对食品和腹泻患者中分离耐环丙沙星大肠埃希菌进行耐药表型及耐药机制等研究。
脑心浸液琼脂(BHA)、脑心浸液肉汤(BHI)均购自北京陆桥技术股份有限公司,Mueller-Hinton肉汤(MHB)、Mueller-Hinton琼脂(MHA)均购自英国Oxoid,庆大霉素(GEN)、氯霉素(CHL)、环丙沙星(CIP)、萘啶酸(NAL)、氨苄西林(AMP)、四环素(TET)、亚胺培南(IMP)、头孢他啶(CAZ)、头孢唑林(CZO)、头孢噻肟(CTX)、复方新诺明(SXT)、替加环素(TGC)、克拉维酸均购自美国Sigma,T载体(pMD18-T Simple Vector)、感受态细胞(E.coli Competent Cells JM109)均购自日本TAKAR。
质粒介导PMQR机制分析[5]:对1.2.1中筛选出对环丙沙星耐药的大肠埃希菌DNA模板进行qepA、qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD、aac(6′)-Ib-cr、oqxAB基因进行PCR扩增,引物由上海生工生物工程有限公司合成。对阳性扩增的产物,送上海英俊公司测序,并将序列在NCBI BLAST上进行比对。
表121株耐环丙沙星菌株来源和耐药谱 Table 1Origin and antimicrobial resistance profiles of 21 ciprofloxacin resistant Escherichia coli cultured from food and diarrheic patients in China |
16株(76.2%,16/21)大肠埃希菌携带了质粒介导的喹诺酮耐药基因,包括oqxA(n=9)、oqxB(n=9)、qnrS(n=5)、aac(6′)-Ib-cr(n=5)和qepA(n=1),6株菌携带1种PMQR,剩余10株菌携带了2种或以上PMQR。其余5株分离株均未检出qnrA、qnrB、qnrC、qnrD基因,见图1。携带PMQR菌株往往具有较高的CIP的MIC值
注:P为腹泻患者来源菌株;F为食品来源菌株;黑框代表阳性;白框代表阴性。 图121株耐环丙沙星菌株耐药特征和耐药机制 Figure 1Molecular characteristics of ciprofloxacin resistant Escherichia coli cultured from food and diarrheic patients in China |
21株菌均携带CTX-M型耐药基因。经测序比对CTX-M型菌株具有8个不同的亚型,分别是CTX-M-3、CTX-M-14、CTX-M-15、CTX-M-24、CTX-M-27、CTX-M-28、CTX-M-65、CTX-M-79,其中CTX-M-14和CTX-M-79型检出数量最多(n=5),见图1。
在肠杆菌科的喹诺酮耐药中,拓扑异构酶的改变(GyrA、GyrB、ParC和ParE),可降低喹诺酮类抗生素对其的亲和力,从而降低微生物对抗生素的敏感性。研究[8]报道在我国大肠埃希菌最主要染色体编码耐喹诺酮耐药决定区突变点是gyrA(S83L/D87N,263株,87.1%),parC(S80I,233株,77.2%),本研究中的结果与此报道的结果一致。大部分菌株具有3~4个突变位点。除此之外,本次研究中除了在常见gyrA和parC上有突变点以外,有6株菌在parE上也有突变点(见图1)。P43仅有一个突变位点(GyrA S83L)呈现低水平的环丙沙星耐药(2 μg/ml)。
在一项覆盖全国30家医院耐氟喹诺酮类大肠埃希菌的调查结果[8]中显示,qnr、aac(6′)-Ib-cr、qepA、oqxAB基因分别占所有菌株的2.7%、24.5%、11.9%、6.3%,其中37.3%菌株至少携带了1种PMQR。本研究中,76.2%(16/21)菌株携带了1种PMQR,具有较高的携带率。
21株分离株均对三代头孢耐药,使临床上对于此类感染疾病用药大大受到限制[5]。进一步分析ESBLs编码基因,发现21株分离株携带编码的耐药基因CTX-M呈现多样性,具有8种不同的CTX-M型别,说明这些菌株来源广泛。其中以CTX-M-14(23.8%,5/21)和CTX-M-79(23.8%,5/21)居多,肠道外感染的患者样本中检测的ESBLs大肠埃希菌往往携带CTX-M-14和CTX-M-15型别[9-10],本研究中CTX-M-14全部来自于腹泻患者,说明该型别是肠道外和肠道内引起感染大肠埃希菌的主要型别。目前国际上对耐药质粒进化研究方法,主要为质粒分型技术,该方法可以检测肠杆菌科耐药质粒的传播和进化,特别是ESBLs的传播特点分析,是今后需要进一步完善的地方。
系统发育分析显示,与致病相关的大肠埃希菌往往属于B2型和D型。在本研究中大部分菌株属于A型(52.4%,11/21)和B1型(23.8%,5/21),仅有2株属于B2型(9.5%,2/21),且均来源于腹泻患者的菌株。在一项连续14年教学医院耐环丙沙星大肠埃希菌研究[3]中发现,38.7%的菌株都属于B2型,且B2型的菌株近几年(2007—2015)已成为优势型别。
耐环丙沙星大肠埃希菌已成为全球重要的食源性致病菌,特别是其具有复杂、可传播的喹诺酮耐药机制,应引起相关部门的广泛重视。本研究通过对耐药菌株耐药表型及耐药机制等的探索,发现食品和腹泻患者来源的耐环丙沙星大肠埃希菌耐药机制具有多样性,携带多种耐药基因质粒存在潜在的传播可能,对公众健康产生巨大威胁。需进一步开展此类耐药菌株的监测,为评估其对人群的健康风险提供基础数据。
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