摘要
利用玻片凝集法对NTS分离株进行血清学分型，采用微量肉汤稀释法测定分离株对14种抗生素的耐药性，使用脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）对分离株进行分子分型并采用BioNumerics 7.6软件聚类分析。
30株NTS分离株共分为15种血清型，主要为里森沙门菌26.67%（8/30）和德尔卑沙门菌16.67%（5/30）。NTS分离株对四环素耐药率为80.00%、氨苄西林76.67%、复方新诺明63.33%，多重耐药率为66.67%，有46.67%的菌株对氨苄西林、四环素、氯霉素和复方新诺明4种抗生素同时产生耐药。PFGE带型具有多态性，无明显的地域聚集性，里森沙门菌带型最为集中。
非伤寒沙门菌（Non-typhoidal Salmonella，NTS）为革兰氏阴性肠杆菌，在自然界中分布广泛，是最重要的食源性病原体之一，约有2 659个血清型，其中99%可能导致动物和人类感
2021年采用随机抽样的方法在枣庄市各区的农贸市场及大型超市进行肉与肉制品的采样，样品类型包括熟肉制品（15份）和生猪肉（47份），样品共计62件。对所采集的样品进行NTS分离培养。
比浊仪、全自动细菌鉴定仪VITEK2及配套鉴定卡片（法国梅里埃公司），内切酶XbaⅠ（日本TaKaRa公司），SeaKem Gold Agarose（瑞士Lonza公司），蛋白酶K（美国MERCK公司），GelRed（美国Biotium公司），1 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L EDTA和5×TBE缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司，QuantStudio5荧光定量PCR仪购自美国Thermo公司，PFGE电泳及成像系统购自美国BIO-RAD公司。以上仪器经过检定校准合格后投入使用。
BPW增菌液、TTB增菌液、SC增菌液、沙门氏菌显色平板、BS培养基、XLT4平板、三糖铁琼脂斜面（北京陆桥技术股份有限公司），脑心浸液琼脂BHA（英国OXOID公司），沙门氏菌血清型鉴定用诊断血清（丹麦SSI公司），沙门氏菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法，深圳生科原生物有限公司），革兰氏阴性需氧菌药敏检测板（复星诊断科技（上海）有限公司）。以上试剂均经过验收合格后在有效期内使用。
NTS定性检测参照GB 4789.4—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验
将分离出的30株NTS采用玻片凝集法进行血清分型，采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原，利用生理盐水进行菌体凝集试验，对于无自凝现象的菌株，用沙门氏菌血清型诊断试剂盒进行多价菌体O抗原和多价鞭毛H抗原的鉴定。具体方法参照《2021年山东省食品污染物和有害因素风险监测工作手册
采用微量肉汤法进行药物敏感性试验，根据革兰阴性需氧菌药敏检测板使用说明书，挑取菌落数个，置于2~3 mL灭菌生理盐水中，用0.5麦氏比浊管进行比浊，调制菌液浓度为1.5×1
参照《山东省食源性疾病主动监测工作手册（2021年版）
从62份肉与肉制品中成功分离出30株NTS，检出率达到48.39%，其中1株分离自熟肉制品，其余29株分离自生猪肉，熟肉制品的NTS阳性率为6.67%（1/15），生猪肉的NTS阳性率为61.70%（29/47），两者差异有统计学意义（
对30株NTS进行血清分型，共鉴定出15种血清型，其中里森沙门菌和德尔卑沙门菌为主要血清型，该两种血清型占到总数的43.33%（13/30）（
| 血清型 | 抗原式 | 菌株数 | 占比/% |
|---|---|---|---|
| 里森沙门菌(S. rissen) | 6,7:g,f:- | 8 | 26.67 |
| 德尔卑沙门菌(S. derby) | 4,12:g,f:- | 5 | 16.67 |
| 伦敦沙门菌(S. london) | 3,10:l,v:1,6 | 2 | 6.67 |
| 阿斯涅沙门菌(S. assinie 2) | 3,10:l,w:z6 | 2 | 6.67 |
| 胥莱士海姆沙门菌(S. schleissheim3) | 4,12:b:- | 2 | 6.67 |
| 启门萨沙门菌(S. kimuenza) | 4,12:l,v:e,n,x | 2 | 6.67 |
| 利文斯顿沙门菌(S. livingstone) | 6,7:d:l,w | 1 | 3.33 |
| 科特布斯沙门菌(S. kottbus) | 6,8:e,h:5 | 1 | 3.33 |
| 鲁齐齐沙门菌(S. ruzizi) | 3,10:l,v:e,z15 | 1 | 3.33 |
| 布兰登堡沙门菌(S. brandenburg) | 4,12:l,v:e,n,z15 | 1 | 3.33 |
| 阿哥纳Ⅱ沙门菌 (S. agonal Ⅱ) | 4,12:f,g,t:z6:z42 | 1 | 3.33 |
| 布达佩斯沙门菌(S. budapest) | 4,12:g,t:- | 1 | 3.33 |
| 鼠伤寒沙门菌(S. typhimurium) | 4,12;i;1,2 | 1 | 3.33 |
| 查理沙门菌(S. chailey) | 6,8:z4,z23:e,n,z15 | 1 | 3.33 |
| 圣保罗沙门菌(S. saintpaul) | 4,12:e,h:1,2 | 1 | 3.33 |
分离出的30株NTS对四环素耐药率最高，达到80.00%，其次为氨苄西林76.67%、复方新诺明63.33%、氨苄西林/舒巴坦56.67%和氯霉素53.33%，该地区的NTS对四环素和氨苄西林耐药现象最严重。NTS分离株的多重耐药率达到66.67%，其中对6~8类抗生素同时耐药的菌株有11株，占到多重耐药菌的55.00%，有46.67%的菌株对氨苄西林、四环素、氯霉素和复方新诺明4种抗生素同时产生耐药。枣庄地区NTS分离株对头孢他啶、头孢噻肟、亚胺培南、头孢西丁和多黏菌素E敏感率为100%。对14种抗生素均不耐药的有4株（13.33%）（
| 抗生素种类 | 名称 | 缩写 | 敏感（S） | 中度敏感（I） | 耐药（R） | 耐药率/% |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 青霉素类 | 氨苄西林 | AMP | 6 | 1 | 23 | 76.67 |
| 氨苄西林/舒巴坦 | AMS | 6 | 7 | 17 | 56.67 | |
| 头孢类 | 头孢他啶 | CAZ | 30 | 0 | 0 | 0.00 |
| 头孢噻肟 | CTX | 30 | 0 | 0 | 0.00 | |
| 头孢唑林 | CFZ | 9 | 10 | 11 | 36.67 | |
| 头霉素类 | 头孢西丁 | CFX | 30 | 0 | 0 | 0.00 |
| 碳青霉烯类 | 亚胺培南 | IMP | 30 | 0 | 0 | 0.00 |
| 四环素类 | 四环素 | TET | 6 | 0 | 24 | 80.00 |
| 氯霉素类 | 氯霉素 | CHL | 14 | 0 | 16 | 53.33 |
| 氨基糖苷类 | 庆大霉素 | GEN | 19 | 0 | 11 | 36.67 |
| 磺胺类 | 复方新诺明 | SXT | 11 | 0 | 19 | 63.33 |
| 大环内酯类 | 阿奇霉素 | AZM | 24 | 0 | 6 | 20.00 |
| 喹诺酮类 | 环丙沙星 | CIP | 15 | 6 | 9 | 30.00 |
| 脂肽类 | 多黏菌素E | CT | 0 | 30 | 0 | 0.00 |
注： 青霉素类、头孢类、头霉素类和碳青霉烯类均属于β-内酰胺类
PFGE分子分型结果显示，菌株DNA条带为11~18条，结果采用BioNumerics 7.6软件聚类分析。按照条带相似度大于85%为标
图1 30株NTS的PFGE聚类分析图
Figure 1 Cluster analysis of PFGE patterns of 30 strains of NTS
我国是全球猪肉生产大国，也是猪肉消费大国，有数据显示我国肉类NTS检出率为1.1%~39.5
使用抗生素是治疗NTS感染的一个重要手段，然而临床对抗生素的不规范使用不仅干扰有益微生物群，影响免疫功能，严重时还会造成菌株的耐药
PFGE是当前细菌分子流行病学研究的“金标准”，是国际公认的食源性传染病暴发流行确认的重要手
本文通过对NTS病原学特征进行分析，了解了枣庄地区肉与肉制品中的NTS分布情况和优势血清型，发现了严重的耐药现象，并初步建立了本地区的NTS的PFGE分子分型数据库，为保障食品安全、规范抗生素的使用、食源性疾病的病原识别、溯源和防控预警提供了有力的科学依据。
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