摘要
本研究中56株DEC菌株中肠道聚集性大肠埃希菌（EAEC）占比最高，达73.2%，且以astA基因为主（90.2%）。56株DEC分为37个ST型，显示高度多样性。DEC菌株对喹诺酮类抗生素耐药性较高（64.3%），其次是对氨基糖苷类、β-内酰胺类抗生素和四环素类抗生素耐药，且多重耐药性菌株占48.2%，耐药基因相应的以喹诺酮类、氨基糖苷类、β-内酰胺类抗生素耐药基因为主，且大多数对抗生素耐药的菌株均携带其相应的耐药基因。
致泻大肠埃希氏菌（Diarrheagenic Escherichia coli， DEC）是我国食源性疾病主要病原体之一，是一类引起人体腹泻为主的大肠埃希菌，可通过污染食物引起人类发
根据DEC的流行病学特征、发病机制及临床特征等，可分为肠致病性大肠埃希菌（Enteropathogenic E. coli，EPEC）、肠产毒性大肠埃希菌（Enterotoxigenic E. coli，ETEC）、肠侵袭性大肠埃希菌（Enteroinvasive E. coli，EIEC）、肠出血性大肠埃希菌（Enterohemorrhagic E. coli，EHEC）和肠聚集性大肠埃希菌（Enteroaggregative E. coli， EAEC）以及弥散黏附性大肠埃希菌（Diffuse adherent E. coli， DAEC
根据《国家食品污染物和有害风险监测工作手册
Illumina Hiseaxten PE150测序仪（美国Illumina公司）。
细菌全基因组提取试剂盒（TaKaRa，宝生物工程有限公司）。药敏板：共15种抗生素：四环素（Tetracycline，TET）、环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、庆大霉素（Gentamicin，GEN）、氨苄西林/舒巴坦（Ampicillin/sulbactam，AMS）、头孢噻肟（Cefotaxime，CTX）、头孢他啶（Ceftazidime，CAZ）、头孢吡肟（Cefepime，FEP）、头孢曲松（Ceftriaxone，CRO）、亚胺培南（Imipenem，IMP）、左氧氟沙星（Levofloxacin，LEV）、复方新诺明（Sulfamethoxazole/Trimethoprim，SXT）、阿米卡星（AMK）、多黏菌素E（Colistin sulphate，CT）、多黏菌素B（Polymyxin B，PB）、萘啶酸（Nalidixic acid，NAL）（珠海美华医疗科技有限公司）。
采用微量肉汤稀释法进行药敏实验，采用革兰氏阴性药敏板检测，依据说明书的检测原理及操作步骤完成：每种抗生素都设有一系列梯度稀释的浓度，通过加入待检DEC肉汤培养液稀释的菌悬液，经18~20 h孵育后，用肉眼对药敏板条进行判读，分析其最低抑菌浓度值，并参考美国临床实验室标准化委员会的标准获得相应敏感（S）、中介（I）和耐药（R）结果。共检测15种抗生素，分别是四环素（2~8 µg/mL）、环丙沙星（0.5~2 µg/mL）、复方新诺明（0.5/9.5~2/38 µg/mL）、庆大霉素（2~8 µg/mL）、氨苄西林/舒巴坦（4/2~16/8 µg/mL）、头孢噻肟（1~32 µg/mL）、头孢他啶（1~16 µg/mL）、头孢吡肟（2~16 µg/mL）、头孢曲松（4~16 µg/mL）、亚胺培南（1~8 µg/mL）、左氧氟沙星（1~8 µg/mL）、复方新诺明（0.5/9.5~2/38 µg/mL）、阿米卡星（8~32 µg/mL）、多黏菌素E（0.5~2 µg/mL）、多黏菌素B（0.5~2 µg/mL）、萘啶酸（0.12~128 µg/mL）。
取适量新鲜菌液，用细菌全基因组提取试剂盒提取DNA。全基因组测序由生工生物工程公司完成，采用Illumina Hiseaxten PE150测序仪进行全基因组分析。测序程序：先将样本DNA随机打断，构建350 bp小片段文库，然后分别进行平行测序，最终获数据量Clean data 100×。数据处理：测序获得原始数据，进行质控，将合格的数据Clean data导入BioNumerics 7.6软件进行序列拼接。
MLST分型参考大肠杆菌分型的管家基因，adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和rec
经BioNumerics软件拼接后的序列，通过序列比对分析获得毒力基因和耐药基因谱。参考官网：Virulence Factor Database（VFDB）（MOH Key Laboratory of Systems Biology of Pathogen，Institute of Pathogen Biology，Beijing，China）（http：//www.mgc.ac.cn）和CARD（https：//card.mcmaster.ca/）。
本研究中收集的DEC来主要来自禽肉（37.5%，21/56），水产品（28.6%，16/56），其次是羊肉（17.9%，10/56）、猪肉（14.3%，8/56）和牛肉（1.8%，1/56）。禽肉包括鸡肉（19.6%，11/56）、鸭肉（5.4%，3/56）、鸽肉（9.0%，5/56）和鹅肉（3.6%，2/56）（
| 样品种类/数量 | 样品储存状态 | DEC菌株占比/% | |
|---|---|---|---|
| 猪肉/8 | 冷却 | 14.3（8/56） | |
| 牛肉/1 | 熟制 | 1.8（1/56） | |
| 羊肉/10 | 冷却 | 12.5（7/56） | |
| 鲜 | 5.4（3/56） | ||
| 水产品/16 | 冷却 | 14.3（8/56） | |
| 鲜 | 14.3（8/56） | ||
| 禽肉/21 | 鸡肉/11 | 鲜 | 10.7（6/56） |
| 冻 | 5.4（3/56） | ||
| 冷却 | 1.8（1/56） | ||
| 鸭肉/3 | 冻 | 3.57（2/56） | |
| 鲜 | 1.8（1/56） | ||
| 鸽肉/5 | 冻 | 1.8（1/56） | |
| 冷却 | 1.8（1/56） | ||
| 鲜 | 5.4（3/56） | ||
| 鹅肉/2 | 鲜 | 3.6（2/56） | |
本研究对56株DEC菌株全基因组测序的原始数据经过分析，满足以下条件：平均测序读长为200~300 bp，原始数据量≥1.5 G，且Q20高质量数据量平均为1.2 G（Clean data≥1 G）；基因组整体覆盖深度≥100 X；剪辑数据质量Q20≥95%，Q30≥85%，SCAFFOLD数量<100个，Contig数量<200个，单碱基错误率低于十万分之一。
根据其携带的毒力基因特点，56株DEC菌株共分为3种，其中EAEC菌株41株（73.2%），其中37株携带astA基因，4株携带pic基因；EPEC菌株14株（25%），携带escV/eae基因，EHEC菌株1株，携带stx2基因。其中来自猪肉、鸡肉、鸽肉、羊肉和水产品的DEC分别为EAEC和EPEC型，分离自鸭肉和牛肉的DEC均为EAEC型。分离自鹅肉的两株DEC分别为EAEC和EHEC型。分离自熟食（牛肉）的DEC为携带astA的EAEC型（
| 样品种类/数量 | EAEC (astA)/数量 | EAEC (pic)/数量 | EPEC(escV/eae)/数量 | EHEC(stx2)/数量 |
|---|---|---|---|---|
| 猪肉/8 | 2 | ND | 6 | ND |
| 鸡肉/11 | 9 | 1 | 1 | ND |
| 鸭肉/3 | 3 | ND | ND | ND |
| 鸽肉/5 | 3 | 1 | 1 | ND |
| 鹅肉/2 | 1 | ND | ND | 1 |
| 牛肉/1 | 1 | ND | ND | ND |
| 羊肉/10 | 6 | 1 | 3 | ND |
| 水产品/16 | 12 | 1 | 3 | ND |
| 合计 | 37 | 4 | 14 | 1 |
注： ND表示没有检出
图1 56株DEC菌株ST型
Figure 1 STs of 56 DEC isolates
图2 56株DEC的耐药性
Figure 2 The resistance of 56 DEC isolates
耐药基因分析显示56株DEC携带的耐药基因种类较多，共对10种抗生素产生耐药性的79种耐药基因，其中对β-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素产生抗性的耐药基因种类最多，分别为26种和18种。见
| 抗生素/耐药基因数量 | 耐药基因种类 |
|---|---|
| Beta-lactam/26 |
产超广谱β内酰胺酶基因：blaTEM-214、blaTEM-209、blaTEM-206, blaTEM-141、blaTEM-1B、blaTEM-234、blaTEM-23、blaTEM-22、blaTEM-217、blaTEM-207, blaTEM-198、blaTEM-186、blaTEM-176、blaTEM-148、blaTEM-126、blaTEM-10、blaTEM-70、blaTEM-30、blaTEM-1C、 blaOXA-4、 blaOXA-10；blaCTX-M-55、 blaCTX-M-65；blaLEN19、 blaLEN16； blaSFO-1；blaDHA1； AmpC酶基因：blaACT-9； blaCMY-2 |
| Aminoglycoside/18 |
氨基糖苷类核苷转移酶基因：aadA1、aadA2、aadA5、 aadA2、aadA24、aadA22、aadA16 磷酸转移酶基因：aph(6)-Id、aph(3'')-Ib、aph(3')-IIa、aph(3')-Ia、aph(4)-Ia 氨基糖苷乙酰转移酶基因：aac(3)-IId、aac(3)-IV、aac(6')-Ib-cr； 核苷酸转移酶基因：ant(2'')-Ia、ant(3'')-Ia 16S rRNA甲基化酶基因：rmtB |
| Macrolide/4 | mdf(A)、mph(A)、lnu(F)、msr(E) |
| Sulphonamide/3 | sul1、sul2、sul3 |
| Tetracycline/4 | tet(A)、tet(M)、 tet(D)、tet(B) |
| Trimethoprim/6 | dfrA1、dfrA17、dfrA12、dfrA14、dfrA5、dfrA27, |
| Phenicol/6 | cmlA1、 floR、cfr、 catB3、catA1、 catA2 |
| Quinolone/7 | qnrS1、oqxB、qnrS2、 oqxA、 qepA1、 qnrB6、 aac(6')-Ib-cr |
| Colistin/2 | mcr-1.1、mcr-9 |
| Fosfomycin/1 | fosA3 |
| Rifampicin/2 | ARR-2、ARR-3 |
根据耐药机制，对β内酰胺类抗生素耐药基因主要包括两大类，一类是产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）基因blaTEM（19种）、blaOXA（2种）、blaCTX-M（1种）、blaLEN（2种）、blaSFO（1种）、blaDHA（1种）。氨基糖苷类耐药基因主要包括五类，分别为氨基糖苷类核苷转移酶基因（7种）、磷酸转移酶基因（5种）、氨基糖苷乙酰转移酶基因（3种）、核苷酸转移酶基因（2种）和16S rRNA甲基化酶基因（1种）。其次为大环内酯类耐药基因（4种）、磺胺类耐药基因（3种）、四环素类耐压基因（4种）、甲氧苄啶类耐药基因（6种）、氯霉素类耐药基因（6种）、喹诺酮氯霉素类耐药基因（7种）、多黏菌素类耐药基因（2种）、磷霉素类耐药基因（1种）、利福平类耐药基因（2种），且41株（73.2%）DEC携带3种及以上抗生素的耐药基因。
本研究中食品分离DEC菌株的多重耐药率高达48.2%（27/56），最多是5重，其次是4重和3重，且检测到其对应的耐药基因（
| 多重耐药类型 | 耐药表型 | 耐药机制 |
|---|---|---|
| 5重 | AMS(CTX, CAZ, CRO）-GEN-TET-SXT-CIP(LEV, NAL) | Beta-lactam、Aminoglycoside、Trimethoprim、Tetracycline、Quinolone |
| 4重 | AMS(CTX, CAZ, CRO）-TET-SXT-CIP(LEV, NAL) | Beta-lactam、 Quinolone、Tetracycline、Trimethoprim |
| 4重 | AMS(CTX, CAZ, CRO)-CIP(LEV, NAL)-TET-GEN | Beta-lactam、Quinolone、Tetracycline、Aminoglycoside |
| 4重 | CIP(LEV, NAL)-GEN-SXT-TET | Quinolone、Aminoglycoside、Trimethoprim、Tetracycline |
| 3重 | CIP(LEV, NAL)-TET-SXT | Tetracycline、Trimethoprim、Quinolone |
| 3重 | AMS(CTX, CAZ, CRO)-CIP(LEV, NAL)-GEN | Beta-lactam、 Quinolone、Aminoglycoside |
| 3重 | AMS(CTX, CAZ, CRO)-CIP(LEV, NAL)-GEN | Beta-lactam、 Quinolone、Aminoglycoside |
| 3重 | AMS(CTX, CAZ, CRO)-CIP(LEV, NAL)-SXT | Beta-lactam、Quinolone、Trimethoprim |
| 3重 | AMS(CTX, CAZ, CRO)-CIP(LEV, NAL)-TET | Beta-lactam、 Quinolone、Tetracycline |
本研究显示2019—2021年上海市肉及肉制品、水产品中分离的DEC以EAEC为主要的型别，构成比高达73.2%（41/56），其次是EPEC（25%）和EHEC（1.78%）型，这与同时期的全国及其他省份的食源性病原菌监测结果一致，2020年全国食源性疾病监测结果显示引起食源性疾病的DEC中EAEC占比最高（52.65%），其次是EPEC（25.15%）、ETEC（18.37%）、EHEC和EIEC占比最低，分别占2.54%和1.38%。相似的监测结果在河南省、江苏省食源性疾病监测中已报
大肠埃希氏菌对喹诺酮类抗生素较高的耐药性在我国较为突出。本研究中，56株DEC对喹诺酮类抗生素（萘啶酸、环丙沙星和左氧氟沙星）均显示较高的耐药性，耐药率分别为64.3%、42.9%和41.1%，这与江苏省报道的食源性疾病DEC对这三种抗生素的耐药率基本一
本研究中48.2%的DEC显示多重耐药性，与广东报道的43.8%的多重耐药
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