摘要
30批次样品中均未检出肉毒毒素；将增菌液进行小鼠腹腔注射后，4批次乳粉样品出现了典型小鼠肉毒中毒症状，但仅从1批次乳粉样品中分离到肉毒梭菌。基因组测序分析显示，该菌为Ⅰ群B型肉毒梭菌，毒素基因簇为Ha型，毒素基因为B2亚型。
肉毒梭菌（Clostridium botulinum）为革兰氏阳性、专性厌氧梭状芽孢杆菌，该菌产生的肉毒毒素（Botulinum neurotoxins，BoNTs）是已知天然毒素中毒力最强的一种神经毒素，共分为7个型（A~G
多数婴儿配方食品并非无菌产品，GB 10765—2021《食品安全国家标准 婴儿配方食品》中规定，婴儿配方食品中的菌落总数不得超过1
2019年，国内发生了一起婴儿肉毒中毒事件，疑似与一家无资质企业生产的婴儿配方乳粉相关。本研究对从该企业获取的30批次样品进行了肉毒毒素和肉毒梭菌检测。根据GB 4789.12—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验
从某起婴儿肉毒中毒事件相关企业抽取共计17批次乳粉样品和13批次原料样品。见
| 编号 | 样品名称 | 编号 | 样品名称 |
|---|---|---|---|
| G-1 | 无乳糖营养配方粉 | G-10 | 无乳糖营养配方粉 |
| G-2 | 氨基酸营养配方粉 | G-11 | 无乳糖营养配方粉 |
| G-3 | 氨基酸优选营养配方粉 | G-12 | 无乳糖营养配方粉 |
| G-4 | 氨基酸优选营养配方粉 | G-13 | 无乳糖营养配方粉 |
| G-5 | 无乳糖营养配方粉 | G-14 | 乳蛋白营养强化复合粉固体饮料 |
| G-6 | 深度水解乳清蛋白配方粉 | G-15 | 无乳糖营养配方粉 |
| G-7 | 无乳糖营养配方粉 | G-16 | 小肽营养配方粉 |
| G-8 | 深度水解乳清蛋白配方粉 | G-17 | 深度水解乳清蛋白配方粉 |
| G-9 | 泹安素黄疸期营养配方粉 |
| 编号 | 名称 | 编号 | 名称 |
|---|---|---|---|
| Y-1 | 含乳食品基料粉双蛋白无乳糖配方粉 | Y-8 | 乳清蛋白粉 |
| Y-2 | 植物脂肪粉（基料粉） | Y-9 | 有机全脂乳粉 |
| Y-3 | 食用葡萄糖 | Y-10 | 全脂羊奶粉 |
| Y-4 | 精氨酸 | Y-11 | 脱脂奶粉 |
| Y-5 | 蛋清肽（白蛋白肽） | Y-12 | 含乳食品基料粉（无乳糖粉） |
| Y-6 | 水解乳清蛋白 | Y-13 | 复配固体饮料营养强化剂（维生素） |
| Y-7 | 浓缩乳清蛋白80% |
LT-IBX450F恒温培养箱（中国立德泰勀科学仪器有限公司），THERMO 1384生物安全柜（美国THERMO公司），CR22GⅢ高速冷冻离心机（日本日立公司），C1000 48SYS PCR仪（美国Bio-rad公司），Autoflex speed基质辅助激光解吸飞行时间质谱（德国Bruker），PL2002天平（瑞士梅特勒公司）。
庖肉培养基基础、庖肉牛肉粒、卵黄琼脂基础、50%卵黄液、胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉汤和TPGYT培养基均购自北京陆桥技术股份有限公司，无水乙醇、磷酸氢二钾、明胶和液体石蜡购自国药集团（中国），胰酶（Gibco）购自赛默飞世尔科技（中国）公司，细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）购自天根生化（北京）科技有限公司，EX Taq酶购自宝生物工程（大连）有限公司，厌氧产气袋购自赛默飞世尔科技（中国）公司，API 20A生化鉴定试剂购自法国生物梅里埃公司，A型、B型、E型、F型肉毒梭菌毒素基因PCR检测的引物合成于北京天一辉远生物科技有限公司，单价抗肉毒毒素诊断血清购自兰州生物制品研究所，标准菌株生孢梭菌CMCC（B）64941为本实验室保存。
参照GB 4789.12—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验
每份样品取有微生物生长的庖肉培养基2管和TPGYT培养基1管，每管分别取上清液3 mL，于3 000 g离心10 min，取上清用于肉毒毒素筛查。其中1份庖肉培养基上清取1.8 mL，加入10%的胰酶0.2 mL，于37 ℃水浴60 min。取上述上清液0.5 mL/只注射小鼠腹腔，每管增菌液注射3只小鼠，观察小鼠48 h内的中毒表现。小鼠如出现竖毛、四肢瘫软，呈现风箱式呼吸、腰腹部凹陷、宛如蜂腰等呼吸困难症状或因呼吸衰竭而死亡，判定该增菌液为肉毒毒素筛查阳性。
取肉毒毒素筛查阳性的样品增菌液，用天根细菌基因组提取试剂盒，按照说明书提取DNA，参照GB 4789.12—2016中肉毒毒素基因PCR检测方法进行A、B、E、F型肉毒毒素基因的筛查。
取肉毒毒素基因筛查阳性的样品增菌液，划线接种卵黄琼脂平板，（35±1） ℃厌氧培养3 d。观察卵黄琼脂分离平板的生长情况，将菌落周围形成乳色沉淀晕圈，表面呈现珍珠样虹彩的可疑菌落转种卵黄琼脂进行分纯，每个样品挑取5个菌落，（35±1） ℃厌氧44~48 h。
对分纯后的可疑肉毒梭菌株进行革兰氏染色、API 20A生化鉴定、基质辅助激光解吸飞行时间质谱（以下简称质谱）鉴定。
挑取纯化后的可疑菌落接种TPGYT培养基，（35±1） ℃厌氧培养22~24 h后，用Tiangen试剂盒提取DNA，参照GB 4789.12—2016中PCR方法检验分离菌株中A、B、E、F型肉毒毒素基因。根据PCR检测结果，使用肉毒毒素诊断血清结合动物实验进行确认。
取分离菌种对应的肉毒素抗体血清，用无菌生理盐水进行1∶1 000稀释。取待确认菌种庖肉培养基增菌后肉汤的1
参照参考文献［
将鉴定与分型明确的肉毒梭菌接种于TPGYT培养基，（35±1） ℃厌氧培养22~24 h后，离心收集菌体，使用天根磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，并使用Qubit dsBR Assay kit测定DNA浓度。三代测序使用PacBio Sequel平台进行测序。构建10K SMRT Bell文库，将经电泳检测合格的DNA样品打断成构建文库所需大小的目的片段，经DNA损伤修复及末端修复并纯化，对特定大小的片段及浓度进行筛选，随后修复DNA损伤，再次对文库纯化，将构建好的文库经Qubit浓度定量，最后用PacBio平台进行测序。对测得的原始数据进行过滤处理，得到有效数据。质控后的有效数据，使用SMRT Link v5.0.1软件（https：//www.pacb.com/support/software-downloads/）对reads进行基因组组装，得到能反映样品基因组基本情况的初步的组装结果。把Reads比对到组装好的基因组序列上，统计Mapping到最长序列的测序深度的分布情况。通过把原始数据比对到初步的组装序列，利用Arrow软件进行组装结果的优化，把存在组装错误的区域进行校正。将优化后的组装结果进行比对分析，并采用二代数据进行校正，筛分染色体与质粒序列，并将染色体序列组装成为一个环状基因组。对组装后的序列使用典型菌种基因组服务器（https：//tygs.dsmz.de/）进行鉴定，使用RAST服务器对基因组进行注释，使用VFDB（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria）数据库分析毒力基因，使用PHASTER（PHAge Search Tool Enhanced Release，https：//phaster.ca/）服务器进行噬菌体分析。将肉毒梭菌菌株的基因组序列文件（Fasta file）上传到TYGS server（https：//tygs.dsmz.de/user_requests/new）及Patric网站中的Similar Genome Finder（https：//www.bv-brc.org/app/GenomeDistance），对该肉毒梭菌进行分析鉴定。该肉毒梭菌菌株的基因组的序列已经上传到北京基因组所（国家生物信息中心）的国家基因组科学数据中心基因组序列库（https：//https：//ngdc.cncb.ac.cn/gwh/documents
13批次原料样品中，Y-4（精氨酸）和Y-13（复配固体饮料营养强化剂）样品处理液腹腔注射小鼠后均出现急性死亡，将两样品的处理液1∶10和1∶100稀释后再分别注射小鼠，均未见异常，表明该样品引起的小鼠急性死亡是样品基质浓度过高所致。17批次乳粉样品的处理液腹腔注射小鼠后，均未见异常。综上，30批次样品中均未检出肉毒毒素。
增菌培养后，所有接种样品的庖肉培养基和TPGYT增菌液均可见微生物生长。经小鼠毒性实验检测，11批次可导致不同程度小鼠中毒症状，其中Y2、Y9、G3、G6、G9、G11和G17样品增菌液1∶10和1∶100稀释后再分别注射小鼠，均未见异常，表明小鼠的中毒症状并非肉毒毒素引起；腹腔注射G4、G5、G8和G16样品增菌液的部分小鼠出现了竖毛、四肢瘫软，呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，9 h后部分小鼠死于呼吸麻痹等疑似肉毒中毒症状（
| 编号 | TPGYT | 庖肉培养基处理方式 | |||
|---|---|---|---|---|---|
| 加热 | 加热+胰酶 | 未加热 | 未加热+胰酶 | ||
| Y-2 |
| 0.5 h死亡（3/3） | 0.5 h死亡（3/3） | — | — |
| Y-9 | — | 0.5 h死亡（3/3） | 0.5 h死亡（3/3） | — | — |
| G-3 | — | 0.5 h死亡（3/3） |
| — | — |
| G-6 | — | — | 0.5 h死亡（3/3） | — | — |
| G-9 | 0.5 h死亡（3/3） | 0.5 h死亡（3/3） | 0.5 h死亡（3/3） | 0.5 h死亡（3/3） | 0.5 h死亡（3/3） |
| G-11 | — | 0.5 h死亡（3/3） | 0.5 h死亡（3/3） | — | 未见异常 |
| G-17 | — | 0.5 h死亡（3/3） | 0.5 h死亡（3/3） | — | 未见异常 |
| G-4 |
有类似肉毒梭菌中毒症 | — | — | — | — |
| G-5 | — | 有类似肉毒梭菌中毒症状，9 h后死亡（3/3） | 有类似肉毒梭菌中毒症状，9 h后死亡（3/3） | 有类似肉毒梭菌中毒症状(3/3)，9 h后死亡(1/3) | — |
| G-8 | — | 0.5 h死亡(3/3) | 0.5 h死亡(3/3) | 有类似肉毒梭菌中毒症状(3/3)，9 h后死亡(1/3) | — |
| G-16 | — | — | — | — | 有类似肉毒梭菌中毒症状（3/3），48 h后死亡(1/3) |
注： *未发现异常
参照GB 4789.12—2016中的PCR方法对导致小鼠疑似肉毒中毒症状的G4、G5、G8和G16样品增菌液进行检测，结果显示G-5和G-8样品疱肉培养基为B型肉毒毒素基因扩增阳性，G4和G16样品增菌液各种亚型基因扩增均阴性。致小鼠疑似肉毒中毒症状的G4、G5、G8和G16样品增菌液在卵黄琼脂分离平板上均出现如下形态的肉毒梭菌疑似菌落：形态扁平、稍粗糙，蔓延生长，边缘不规则，菌落周围可见乳色沉淀晕圈，菌落表面呈现珍珠样虹彩。显微镜下呈革兰氏阳性棒状杆菌，芽孢位于菌体一端，类似网球拍状，该菌在血平板上可见溶血环，经API 20A生化鉴定、质谱鉴定和16S rRNA序列测定，与生孢梭菌（C.sporogenes）不能区分。
参照GB 4789.12—2016中的PCR方法对分离纯化的肉毒梭菌疑似菌落检测显示，G4、G8和G16样品来源菌落均未检出肉毒毒素基因，G-5样品来源菌落G-5p2 B型肉毒毒素基因扩增阳性。G-5样品来源肉毒梭菌可疑菌落G-5p2庖肉培养物经1∶10~1∶10 000稀释后，均可致小鼠死亡（2只/组），小鼠肉毒中毒症状为：注射培养物后1.5~2 h出现竖毛、四肢瘫软，呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，4~48 h死于呼吸麻痹。1∶100 000稀释后，两只小鼠均出现中毒症状，最终1只恢复，1只死亡；1∶1 000 000稀释后，两只小鼠均未见中毒症状。由此计算分离菌株庖肉培养物对小鼠的最低致死剂量为20 000 MLD/mL。B型肉毒毒素抗血清对小鼠可形成有效保护，加热后的培养物对小鼠未见毒性。
对肉毒梭菌G-5p2基因组测序结果分析显示，分离菌种染色体大小为3 902 164 bp，携带一个21 598 bp质粒，质粒上未见毒力相关基因（
| 种类 | 基因组大小/bp | 基因数量 | 编码基因长度/bp | GC含量/% | 基因平均长度/bp |
|---|---|---|---|---|---|
| 染色体 | 3 902 164 | 3 657 | 3 217 590 | 28.25 | 879.84 |
| 质粒 | 21 598 | 33 | 13 990 | 25.47 | 424.09 |
使用VFDB数据库对测序结果分析，共计识别出7个毒素编码相关基因（
| 基因名称 | 起止位点 | 基因功能 |
|---|---|---|
| atx | 944 915~948 790 | 编码肉毒毒素 |
| colA | 1 795 213~1 798 842 | 编码胶原酶 |
| cloSI | 2 095 136~2 096 710 | 编码半胱氨酸蛋白酶 |
| orf01496 | 1 626 909~1 627 547 | 编码溶血素 |
| orf01628 | 1 761 625~1 762 275 | 编码溶血素 |
| orf01844 | 2 017 502~2 018 338 | 编码溶血素 |
| orf02857 | 3 076 642~3 077 781 | 编码溶血素 |
图1 肉毒梭菌5P2毒素基因簇基因注释图
Figure 1 Gene annotation of Clostridium botulinum 5P2 toxin gene cluster
注： ha-17：血凝集素相关基因；mtx：Mosquitocidal toxin编码基因；botR：毒素表达调控基因；ntnh：非毒素非血凝素基因NTNH蛋白；bont：肉毒毒素编码基因
将G-5P2基因组中肉毒毒素基因序列与已知B型肉毒素梭菌8个亚型的毒素基因参考序列使用Mega-X构建系统发育图并计算氨基酸序列的差异。如
图2 5P2肉毒毒素基因序列与B型肉毒素梭菌8个亚型肉毒毒素基因参考序列Mega-X构建系统发育图
Figure 2 Phylogenetic diagram of 5P2 botulinum toxin gene sequence and Mega-X reference sequence of botulinum toxin gene of 8 subtypes of Clostridium botulinum type B
肉毒梭菌按生化、生理和基因特征可分为4个群（Ⅰ~Ⅳ群），这些群呈现出非常多样化的表型和基因型特
由于婴儿肠道菌群不健全及抑制梭菌繁殖的胆汁酸较低，从外界摄入的肉毒梭菌芽孢可在肠中定植、繁殖，产生肉毒毒素。报道显示，婴儿配方奶粉可能是导致婴儿型肉毒中毒的原因之
生孢梭菌与肉毒梭菌无论在菌落形态、显微镜下的特征均难以区分，其生化反应和16S rDNA序列都与肉毒梭菌高度相
对不同肉毒梭菌菌株的基因组序列进行分析后发现，编码肉毒毒素的基因位于染色体、质粒或噬菌体上，并可以通过水平转移、基因重组等方式在不同梭菌属菌株之间转
综上，为避免肉毒梭菌的漏检，针对背景微生物复杂的婴儿配方乳粉中肉毒梭菌检测，建议不以菌种分离作为金标准，而应以增菌液小鼠毒性实验结合肉毒抗血清保护实验作为确认方法。如分离到肉毒梭菌，结合基因组测序手段可对菌种进行精准鉴定和相关生物信息学分析，可为相关中毒事件暴发处理提供可靠的技术支撑。
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