摘要
维生素D是固醇类衍生物，主要包括维生素D2（麦角钙化醇）和维生素D3（胆钙化醇）。维生素D在体内钙和磷酸盐代谢中起关键作用，对婴幼儿骨骼发育至关重要，补充维生素D可预防婴幼儿营养性佝偻病。婴幼儿食品属于特殊食品，国际组织和我国对婴幼儿食品中维生素D设定了限量要求，以保障婴幼儿配方食品的安全以及规范其生产经营。现有的婴幼儿食品中维生素D定量检测的标准方法主要有液相色谱
本文对PTAD衍生法结合液相色谱串联质谱法测定婴幼儿食品，包括婴幼儿液态奶、配方奶粉、谷物辅食等。前处理优化了皂化条件，保证回收率的同时减少了内标的使用量，大大节省检测费用，扩大检测范围，克服了基质效应存在干扰峰的问题，建立选择性强、灵敏度高，适用于婴幼儿配方食品中维生素D准确定量的方法。
LC-MS/MS 8050液相色谱串联质谱（日本岛津公司），恒温水浴摇床（德国Memmert公司），TurboVa
甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；无水乙醇（色谱纯，Fisher Chemical公司）；甲酸铵（色谱纯，CNW公司）；α-淀粉酶（CAS#9001-19-8 BR，4 000 U/g，上海源叶生物科技有限公司）；维生素D2（CAS号：50-14-6，纯度99.6%，Sigma Aldrich），维生素D3（CAS号：67-97-0，纯度98.84%，Dr. Ehrenstorfer），维生素D2-d3内标（CAS号：1217448-46-8，100 μg/mL，First Standard），维生素D3-d3内标（CAS号：80666-48-4，103.9 μg/mL，First Standard）；PTAD、TRC、L（+）-抗坏血酸、氢氧化钾、乙醇、石油醚Ⅰ和丙酮均为分析纯。
维生素标准溶液的配制：用乙醇配制维生素D标准溶液（质量浓度10 mg/L），使用前需校正。再逐级稀释配成0.5~50 μg/L的维生素D标准工作液，每毫升标准工作溶液含有10 ng的维生素D内标。
PTAD衍生试剂：用丙酮配制质量浓度为10 mg/mL。
离子源：电喷雾正离子（ES
| 项目 | 母离子/（m/z） | 定量子离子/（m/z） | 定性子离子/（m/z） | 保留时间/min | Q1/V | CE/V | Q3/V |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 维生素D2 | 572.20 | 298.00 | 280.00 | 4.8 | 52.2 | -18.0 | -13.0 |
| 维生素D2-d3 | 575.20 | 301.15 | 283.20 | 4.8 | -30.0 | -17.0 | -19.0 |
| 维生素D3 | 560.20 | 298.00 | 280.00 | 4.9 | -28.0 | -18.0 | -13.0 |
| 维生素D3-d3 | 563.20 | 301.15 | 283.20 | 4.8 | -30.0 | -20.0 | -13.0 |
注： 质量准确性≤0.5 u
色谱柱：Atlanti
| 时间/min | 流速/（mL/min） | 5 mmol/L甲酸铵/% | 甲醇/% |
|---|---|---|---|
| 0.01 | 0.3 | 5 | 95 |
| 2.00 | 0.3 | 2 | 98 |
| 5.00 | 0.3 | 2 | 98 |
| 5.50 | 0.3 | 5 | 95 |
| 10.0 | 0.3 | 5 | 95 |
谷物类样品（含淀粉样品）：粉碎均质后，存于样品瓶。准确称取样品2.5 g于250 mL三角瓶，加入1 g抗坏血酸、0.5 g α-淀粉酶和30 mL纯水，摇匀后置60 ℃水浴振荡器，振荡酶解30 min。
奶粉样品：准确称取样品2.5 g于250 mL三角瓶，加入1 g抗坏血酸和30 mL 60 ℃温水，摇匀。
液态奶：准确称取样品10 g于250 mL三角瓶，加入1 g抗坏血酸和20 mL纯水，摇匀。
预处理后的样品溶液加入30 mL乙醇和12 mL 50%氢氧化钾水溶液，振摇1 min，充氮气1 min，排出三角瓶内的空气，加盖拧紧，置80 ℃水浴振荡器振荡60 min。取出冷却至室温。
本研究对样品前处理关键操作进行细化和优化。实验确定的皂化条件为皂化温度80 ℃，皂化时间60 min。充氮气后保持皂化容器的气密性，防止维生素在高温皂化时被氧化分解。实验确定液-液萃取提取溶剂为低沸点的石油醚Ⅰ，既可降低浓缩的温度，同时缩短浓缩时间，避免维生素D损失。实验确定的液-液萃取次数为两次，可萃取完全，提高回收率。
在以上确定的实验条件下，维生素D回收率理想，不需要在样品预处理时加入内标物用以校正样品前处理的回收，减少了内标物的使用量，大大节约实验成本。
本研究采用PTAD与维生素D进行衍生化反应，形成易于电离的高分子的衍生物，显著提高了化合物的液相质谱测定的灵敏度。衍生反应式见
图1 维生素D2衍生化反应
Figure 1 Derivative reaction of vitamin D2
图2 维生素D3衍生化反应
Figure 2 Derivative reaction of vitamin D3
图3 某配方奶粉样品国标法测定MRM色谱图
Figure 3 MRM chromatogram of a formula milk powder sample determined by national standard method
图4 某谷物辅食样品国标法测定MRM色谱图
Figure 4 MRM chromatogram of Cereal-based complementary foods sample determined by national standard method
图5 维生素D3标准溶液（2 μg/L） 本法MRM色谱图
Figure 5 MRM chromatogram of vitamin D3（2 μg/L） determined by the method
图6 维生素D2标准溶液（2 μg/L） 本法MRM色谱图
Figure 6 MRM chromatogram of vitamin D2（2 μg/L） determined by the method
图7 某配方奶粉样品本法测定MRM色谱图
Figure 7 MRM chromatogram of a formula milk powder sample determined by the method
图8 某谷物辅食样品本法测定MRM色谱图
Figure 8 MRM chromatogram of Cereal-based complementary foods sample determined by the method
选取配方奶粉样液和标准工作曲线最高点维生素D质量浓度为50 μg/L标准溶液进行PTAD的衍生化反应效果实验，结果见
| PTAD添加量/μL | 5 | 10 | 20 | 30 | 50 | 75 | 100 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 奶粉样液/（μg/kg） | 76.1 | 76.7 | 79.7 | 81.1 | 80.2 | 79.3 | 78.8 |
| 50 μg/L标准溶液结果/（μg/L） | 44.1 | 45.3 | 50.3 | 52.2 | 52.2 | 50.8 | 51.6 |
选取质量浓度为0.500 μg/L的衍生化标准溶液，保存时间选择1周，-18 ℃冷冻保存。测试衍生化标准溶液中衍生化合物的剩余分析物为100%（n=3）。选取婴儿配方奶粉和营养米粉样品进行稳定性测试，按本法“1.3.3”进行前处理实验，分别吸取2、5和10 mL提取液氮吹，衍生后得到不同浓度的待上机样液，在-18 ℃冷冻保存放至1周，期间在不同时间点取出上机测试，其样品结果相对标准偏差在1.0%~2.3%之间。实验结果表明本法提取衍生反应5 min即达平衡，且不受浓度影响，样液冷冻保存1 w无显著变化。
图9 衍生时间试验
Figure 9 Effect of derivatization time
本法采用甲醇-5 mmol/L甲酸铵水溶液两相作为流动相，经实验优化采用梯度洗脱，维生素D2和维生素D3以及氘代内标物的MRM色谱图见
图10 维生素D2标准溶液（2 μg/L）MRM色谱图
Figure 10 MRM chromatogram of vitamin D2 standard (2 μg/L)
图11 维生素D2-D3内标标准溶液（10 μg/L）MRM色谱图
Figure 11 MRM chromatogram of vitamin D2-D3 standard (10 μg/L)
图12 维生素D3标准溶液（2 μg/L）MRM色谱图
Figure 12 MRM chromatogram of vitamin D3 standard (2 μg/L)
图13 维生素D3-D3内标标准溶液（10 μg/L）MRM色谱图
Figure 13 MRM chromatogram of vitamin D3-D3 standard (10 μg/L)
在上述液相色谱质谱条件下，配制系列质量浓度维生素D混合标准溶液进行衍生化反应后，以分析物与内标物峰面积比（y）对分析物与内标物的质量浓度（x）作校正曲线，得到线性回归方程与相关系数见
| 名称 | 线性方程 | 相关系数 | 线性范围/ （μg/L） |
|---|---|---|---|
| 维生素D2 | y=0.078 732 7x+0.024 483 6 | 0.999 7 | 0.500~50.0 |
| 维生素D3 | y=0.090 477 4x-0.002 593 54 | 0.999 9 | 0.500~50.0 |
本文选用配方奶粉（购自厂家无添加维生素D的配方奶粉样品），按照本法进行回收率和精密度实验，维生素D的空白样品和添加定量水平的MRM色谱图见
图14 空白配方奶粉维生素D2 MRM色谱图
Figure 14 MRM chromatogram of blank formula milk powder sample
图 15 配方奶粉添加维生素D2MRM色谱图
Figure 15 MRM chromatogram of formula milk powder sample spiked with vitamin D2
图16 空白配方奶粉维生素D3 MRM色谱图
Figure 16 MRM chromatogram of blank formula milk powder sample
图17 配方奶粉添加维生素D3MRM色谱图
Figure 17 MRM chromatogram of formula milk powder sample spiked with vitamin D3
| 加标水平/（μg/kg） | 平均回收率/% | 变异系数（CV）/% | |
|---|---|---|---|
| 维生素D2 | 1.00 | 93.7 | 3.03 |
| 10.0 | 92.3 | 4.46 | |
| 50.0 | 94.1 | 3.39 | |
| 维生素D3 | 1.00 | 93.8 | 4.85 |
| 10.0 | 94.0 | 5.34 | |
| 50.0 | 94.2 | 4.36 |
从
| 方法 | 检出限/（μg/kg） | 定量限/（μg/kg） | 线性范围/（μg /kg） | 内标使用量/μg | 适用样品 | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 维生素D2 | 本法 | 0.5 | 1.0 | 0.50~50 | 0.01 | 食品 |
| GB 5009.82—2016（第三法） | 10 | 30 | 10.0~200 | 0.1 | 食品 | |
| ISO 20636: 2018 | 0.4 | 1.5 | 0.4~50 | 0.5 | 奶粉/液奶/营养素 | |
| 维生素D3 | 本法 | 0.5 | 1.0 | 0.50~50 | 0.01 | 食品 |
| GB 5009.82—2016（第三法） | 2.0 | 6.0 | 10.0~200 | 0.1 | 食品 | |
| ISO 20636: 2018 | 0.4 | 2.5 | 0.4~50 | 0.5 | 奶粉/液奶/营养素 |
采用本法测试婴幼儿配方食品，包括液态类、奶粉类和谷物类样品，检测结果见
| 品名 | 产品标示值 | GB 5009.82—2016（第三法） | 本法 |
|---|---|---|---|
| 婴儿配方液态奶/(μg/L) | 10 | 14.1 | 14.9 |
| 婴儿配方奶粉/(μg/100 g) | 7.5 | 9.00 | 9.25 |
| 较大婴儿配方奶粉/(μg/100 g) | 7.5 | 10.7 | 9.59 |
| 幼儿配方奶粉/(μg/100 g) | 7.8 | 10.0 | 9.90 |
| 婴幼儿谷物辅助米粉/(μg/100 g) | 4.7 | 6.56 | 5.30 |
本研究建立了衍生法结合液相色谱串联质谱法测定婴幼儿配方食品中维生素D，样品前处理经过皂化、提取、浓缩后，采用PTAD衍生化反应，与同类液相色谱质谱法相比，方法灵敏度高，选择性强，有效降低了样品基质干扰。本方法同时优化样品前处理皂化和液-液萃取条件，显著提高了方法的回收率，同位素内标法定量，精密度好，可满足婴幼儿配方食品的定性、定量测定。
参考文献
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