饮食中的B族维生素可以调理人体正常功能与代谢活动，其水平与健康成年人的记忆功能有
核黄素-5'-磷酸钠（分子式C17H20N4NaO9P·2H2O）是常用的食品添加剂成分，作为食品强化剂、食用黄色素，另外还用于医药，是维生素B2的水溶性制剂。法规规定核黄素-5'-磷酸钠中核黄素（分子式C17H20N4O6）含量范围是73.0%~79.0%（w/%
高效液相色谱法从80年代起就是欧洲标准中检测维生素B1、维生素B2的官方方
本研究按照GB 5009.85—2016《食品安全国家标准 食品中维生素B2的测定》第一法的要求，考察了不同来源的高峰淀粉酶和酶孵育体系pH值、孵育时间对某功能型饮料中维生素B2检出值的影响。
电子天平（感量0.01 mg，Sartorius BP211D），高效液相色谱仪-荧光检测器（Agilent 1290 Infinity Ⅱ），pH计（Schott Lab 870），涡旋振荡器（德国艾卡IKA Vortex 2），恒温培养箱（上海跃进医疗器械一厂）， 超纯水装置（美国密理博Millipore Milli-Q）。
一级水，临用时以超纯水系统制备，盐酸（36.0%~38.0%，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司），冰乙酸（≥99.7%，色谱纯，TEDIA），氢氧化钠（≥96.0%，分析纯，国药集团化学试剂有限公司），三水乙酸钠（≥99.0%，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司），甲醇（≥99.9%，色谱纯，上海柯灵斯试剂有限公司），木瓜蛋白酶（6 000 U/mg，国药沃凯），待测高峰淀粉酶（100 U/mg，分别来自于A、B、C、D四个公司）。
标准物质：维生素B2（分子式C17H20N4O6，分子量376.36，纯度≥98%，CAS号83-88-5，Sigma-Aldrich公司），核黄素-5'-磷酸钠（分子式C17H20N4NaO9P，分子量478.33，纯度93.15%，CAS号130-40-5，上海阿拉丁生化科技服务有限公司）。
市售某品牌保健饮料（配方中核黄素-5'-磷酸钠添加量：5.62 mg/100 mL，维生素B2理论含量4.11 mg/100 mL），由上海大正力保健有限公司提供。同时提供不含核黄素-5'-磷酸钠的受试样品作为阴性样品。
取1.00 mL浓度为10.00 mg/100 mL的核黄素-5'-磷酸钠标准溶液，用水稀释至100 mL，进样测得含维生素B2 6.04 μg。相应的，1.00 mL浓度分别为5 mg/100 mL和1 mg/100 mL核黄素-5'-磷酸钠标准溶液，本底维生素B2含量分别为3.02 μg和0.604 μg。
核黄素-5'-磷酸钠与维生素B2的折算系数==0.786 8，折算后1.00 mL三种浓度的核黄素-5'-磷酸钠中维生素B2含量分别为7.87、39.34、78.68 μg。
不同来源的高峰淀粉酶酶解核黄素-5'-磷酸钠标准溶液的能力不同，见
图 1 不同来源的高峰淀粉酶对核黄素-5'-磷酸钠标准溶液的酶解效率
Figure 1 Enzymatic hydrolysis efficiency of different sources of Taka-diastase on riboflavin-5-sodium phosphate standard solutions
在阴性样品中添加核黄素-5'-磷酸钠标准储备液，使其浓度分别为1.00、5.00和10.00 mg/100 mL。各取1.00 mL，选择上述实验中酶解效果最好的两种高峰淀粉酶对其进行酶解，结果见表1-2。结果表明，除去核黄素-5'-磷酸钠之外，受试样品溶液稀释体系对高峰淀粉酶的作用几乎没有影响。
| 样品管编号 | 酶解后核黄素含量/μg | 本底核黄素含量/μg | 折算核黄素含量/μg | 酶解效率/% | 平均酶解效率/% |
|---|---|---|---|---|---|
| 1-1 | 8.43 | 0.60 | 7.87 | 99.5 | 98.5 |
| 1-2 | 8.38 | 98.8 | |||
| 1-3 | 8.26 | 97.3 | |||
| 2-1 | 42.00 | 3.02 | 39.34 | 99.1 | 98.5 |
| 2-2 | 41.73 | 98.3 | |||
| 2-3 | 41.58 | 98.1 | |||
| 3-1 | 83.41 | 6.04 | 78.68 | 98.3 | 98.8 |
| 3-2 | 84.11 | 99.2 | |||
| 3-3 | 83.85 | 99.0 |
| 样品管编号 | 酶解后核黄素含量/μg | 本底核黄素含量/μg | 折算核黄素含量/μg | 酶解效率/% | 平均酶解效率/% |
|---|---|---|---|---|---|
| 1-1 | 8.40 | 0.60 | 7.87 | 99.1 | 98.4 |
| 1-2 | 8.34 | 98.3 | |||
| 1-3 | 8.31 | 97.9 | |||
| 2-1 | 41.86 | 3.02 | 39.34 | 98.8 | 98.2 |
| 2-2 | 41.62 | 98.1 | |||
| 2-3 | 41.48 | 97.8 | |||
| 3-1 | 84.02 | 6.04 | 78.68 | 99.1 | 98.2 |
| 3-2 | 83.52 | 98.4 | |||
| 3-3 | 82.54 | 97.2 |
四家国内外供应商提供的高峰淀粉酶处理受试样品结果如
| 来源 | 样品管编号 | 样品中含量/(mg/100 mL) | 平均含量/(mg/100 mL) | 相对标准偏差/% |
|---|---|---|---|---|
| A公司 | 1 | 3.77 | 3.73 | 1.21 |
| 2 | 3.73 | |||
| 3 | 3.68 | |||
| B公司 | 1 | 3.84 | 3.68 | 4.63 |
| 2 | 3.69 | |||
| 3 | 3.50 | |||
| C公司 | 1 | 2.82 | 2.82 | 2.13 |
| 2 | 2.88 | |||
| 3 | 2.76 | |||
| D公司 | 1 | 0.35 | 0.37 | 5.98 |
| 2 | 0.39 | |||
| 3 | 0.38 |
由
GB 5009.85—2016中未规定具体酶解时间，仅叙述为“过夜酶解”。过夜酶解通常理解为酶解时间不短于12 h，因此选择12、16和18 h三种酶解时间进行对比试验，根据上述结果选择A公司的高峰淀粉酶酶解，其他实验步骤仍按照GB 5009.85—2016进行。对比酶解12、16和18 h的酶解效果，结果见
图 2 四家不同供应商提供的高峰淀粉酶的酶解效果色谱图
Figure 2 Chromatograms of enzymatic hydrolysis of Taka-diastase from four different suppliers
图3 不同酶解时长的酶解效果
Figure 3 Influence of enzymolysis duration on the recovery of riboflavin
结果表明，酶解12 h后，测得的维生素B2含量不再有明显变化，认为此时底物已经酶解完全，可根据日常工作时间和工作安排需要选择不少于12 h的任意酶解时间。
GB 5009.85—2016中酶解pH为6.0~6.5，此范围不明确。因此对比pH 6.0和pH 6.5的酶解效果，根据上述结果选择A公司的高峰淀粉酶酶解，使用1 mol/L氢氧化钠溶液将样品分别调pH至6.0和6.5后，加入酶液，过夜酶解16 h，其他实验步骤仍按照GB 5009.85—2016进行。样品pH值分别为6.0和6.5的酶解结果见
结果表明，6.0和6.5的pH值对实验结果影响较小，且精确调节pH操作较费时，因此实际操作时可自行选择6.0~6.5之间的pH值都可达到完全酶解的效果。
将1.2.3配制的维生素B2标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积。以标准工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
分6 d制作的6条标准曲线的线性方程、相关系数r以及斜率的相对标准偏差见
| pH值 | 样品管编号 | 进样浓度/(μg/mL) | 样品中含量/(mg/100 mL) | 平均含量/(mg/100 mL) | 相对标准偏差/% |
|---|---|---|---|---|---|
| 6.0 | 1 | 0.391 | 3.91 | 3.84 | 1.52 |
| 2 | 0.380 | 3.80 | |||
| 3 | 0.382 | 3.82 | |||
| 6.5 | 1 | 0.378 | 3.78 | 3.75 | 0.96 |
| 2 | 0.371 | 3.71 | |||
| 3 | 0.376 | 3.76 |
| 时间/d | 线性方程 | r | 斜率相对标准偏差 |
|---|---|---|---|
| 1 | y=157.47x+0.138 0 | 0.999 98 | 1.30% |
| 2 | y=155.85x+0.350 0 | 0.999 97 | |
| 3 | y=158.66x+0.348 2 | 0.999 96 | |
| 4 | y=157.40x+0.354 7 | 0.999 96 | |
| 5 | y=155.96x+0.291 0 | 0.999 96 | |
| 6 | y=152.83x+0.293 0 | 0.999 99 |
根据标准曲线最低点时维生素B2的信噪比，配制浓度为1 ng/mL的维生素B2标准溶液，进样分析其信噪比。信噪比大于3时的浓度为检出限，信噪比大于10时的浓度为定量限，结果见
| 序号 | 浓度/（ng/mL） | 信噪比(S/N) | 信噪比(S/N)平均值 |
|---|---|---|---|
| 1 | 1.00 | 36.9 | 36.9 |
| 2 | 1.00 | 37.0 | |
| 3 | 1.00 | 36.7 |
由此计算信噪比为3时，维生素B2的浓度为（1.00×3）/36.9=0.08 ng/mL，当取样1.00 mL时，按方法处理后，进样20.0 µL时，维生素B2的检出限为0.000 8 mg/100 mL，小于标准文本中规定的0.02 mg/100 mL，满足维生素B2测定的需求。
信噪比为10时，维生素B2的浓度为（1.00×10）/36.9=0.27 ng/mL，当取样1.00 mL时，按方法处理后，进样20.0 µL时，维生素B2的定量限为0.0027 mg/100 mL，小于标准文本中规定的0.05 mg/100 mL，满足维生素B2测定的需求。
使用同一瓶样品取6份，按照1.2.2方法处理后，进样分析，计算6份样品的相对标准偏差，结果见
| 测定次数 | 取样量/mL | 样品中含量/(mg/100 mL) | 平均含量/(mg/100 mL) | 相对标准偏差/% |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 1.00 | 3.74 | 3.80 | 1.09 |
| 2 | 1.00 | 3.82 | ||
| 3 | 1.00 | 3.85 | ||
| 4 | 1.00 | 3.79 | ||
| 5 | 1.00 | 3.82 | ||
| 6 | 1.00 | 3.76 |
取精密度同一瓶样品，在1 mL样品中分别加入折算核黄素浓度为100 μg/mL的核黄素-5'-磷酸钠标准溶液200、400和600 μL，混匀。每个浓度各3份，按照1.2.2方法处理后，进样分析。样品本底含量为精密度实验测得的3.80 mg/100 mL。回收率结果见
| 加标量/μg | 编号 | 实测含量/μg | 回收率% | 平均回收率% |
|---|---|---|---|---|
| 20 | 1 | 56.9 | 94.5 | 94.7 |
| 2 | 57.2 | 96.0 | ||
| 3 | 56.7 | 93.5 | ||
| 40 | 1 | 74.3 | 90.8 | 91.4 |
| 2 | 74.6 | 91.5 | ||
| 3 | 74.8 | 92.0 | ||
| 60 | 1 | 92.2 | 90.3 | 90.5 |
| 2 | 92.5 | 90.8 | ||
| 3 | 92.2 | 90.3 |
各加标水平回收率在90.5%~94.7%范围内，表明该方法的准确度满足所验证样品中维生素B2含量测定的需求。
维生素B2大多是以FMN、FAD的形式呈现，与蛋白质结合存在于食物中，于吸收前需先降解为游离形式的维生素B2，本文目标检测物核黄素-5'-磷酸钠是FMN的钠盐形式，按照GB 5009.85—2016的方法要求，需要将其转化为游离形式后，才方便后续用高效液相色谱法或荧光分光光度法检测。饮料中添加的酸稳定性、热稳定性的核黄素-5'-磷酸钠无法通过酸处理或者加热的方法变成游离维生素B
高峰淀粉酶是一种从曲霉属的各种霉菌真菌的菌丝和孢子中获得的酶制剂，由淀粉酶、核糖核酸酶、磷酸酶和蛋白水解酶等组
综上，高峰淀粉酶之磷酸酶活性的强弱及稳定性影响着维生素B2的检测，尤其对于那些含有高水平FMN的检测样品，实际检出结果容易与理论值产生较大的差异。本文遵循国标方法规定，高峰淀粉酶的用法、用量是固定的，该酶自身磷酸酶活性的强弱及稳定性就对检测结果起到了至关重要的作用，需要在使用之前先考察该酶之磷酸酶活性。结果可以看出，不同来源的高峰淀粉酶，酶解核黄素-5'-磷酸钠的效率不同，而这种酶解效率的差异直接导致了维生素B2检测结果的差异。通过使用不同供应商来源的高峰淀粉酶对添加核黄素-5'-磷酸钠的同一样品进行处理后，测得的维生素B2的含量差异很大，最低检出值（0.37 mg/100 mL）仅为最高检出值（3.73 mg/100 mL）的十分之一，与理论值更是相差10倍以上。由此可见，在利用高峰淀粉酶检测含有核黄素-5'-磷酸钠的样品之前，需要先确定其酶解磷酸根的能力。推荐通过酶解核黄素-5'-磷酸钠标准品的方法确定可用来源的酶，因为标准溶液酶解结果（
D公司供应的高峰淀粉酶标注的淀粉酶活力最强，推测其制备工艺含有淀粉酶的纯化流程，而纯化过程可能使磷酸酶的活性减弱，从而使该酶处理过的受试样品中维生素B2的检出率最低。此外，若国标方法中的工具酶添加磷酸酶一项，也可以有效保证各色样品中维生素B2检出率的稳定性，但是磷酸酶的价格昂贵，如此会大大提高检测的成本。此外，受试饮料中不含有蛋白质，此处运用的木瓜蛋白酶没有起到酶解功效，反而可能影响高峰淀粉酶的活性，比如D公司供应的高峰淀粉酶中恰好含有木瓜蛋白酶的水解基团，因为功能区域被酶解而活性降低，以至于维生素B2的检出率最低，这个需要进一步的实验加以验证。关于木瓜蛋白酶的影响，意大利科学
本项研究仅检测了一种功能型饮料，是因为它十分具有代表性：在诸多添加了B族维生素的保健功能饮料中，目前仅有它以核黄素-5'-磷酸钠（并非直接添加核黄素）作为维生素B2的来源。以它作为受试样品并由此引发的对国标方法的探讨，对于肉类、乳制品等天然来源的富含维生素B2磷酸盐的样品而言，是十分必要和有意义的。在2018年，同样参考国标方法，中国疾控系统对乳制品中维生素B2进行质控考核结果分析，17家参加实验室中，有13家测得值低于指定值，还有4家低于允许偏差范
对于富含核黄素磷酸盐的样品，高峰淀粉酶影响维生素B2检出结果的准确性，建议在用国标方法检测时，先考察所使用的高峰淀粉酶对核黄素-5'-磷酸钠标准溶液的酶解能力，确定高峰淀粉酶活性能否满足酶解磷酸根的需求，以确保检测结果的准确性。
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