基于蛋白沉淀法超高效液相色谱-串联质谱法检测面包中两种蛋白结合型晚期糖基化终末产物

江冠桦，余海立，王培，汪强，陈梁凯，张彦，刘烈刚; JIANG Guanhua; YU Haili; WANG Pei; WANG Qiang; CHEN Liangkai; ZHANG Yan; LIU Liegang

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基于蛋白沉淀法超高效液相色谱-串联质谱法检测面包中两种蛋白结合型晚期糖基化终末产物 PDF

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1. 华中科技大学同济医学院公共卫生学院营养与食品卫生学系,湖北武汉 430030； 2. 安琪酵母股份有限公司酵母功能湖北省重点实验室,湖北宜昌 443000

中图分类号： R155

最近更新：2023-07-03

DOI：10.13590/j.cjfh.2023.04.005

摘要

目的

建立面包中两种典型晚期糖基化终末产物（AGEs）的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。

方法

以结合型羧甲基赖氨酸（CML）和羧乙基赖氨酸（CEL）为检测对象，面包样品经还原孵育、蛋白沉淀、加同位素内标、酸水解、氮吹、九氟戊酸水溶液复溶后，多反应监测定性及定量分析。

结果

方法的检出限CML为4.5 ng/g，CEL为0.5 ng/g；定量限CML为20 ng/g，CEL为2 ng/g；CML加标回收率为89.62%~95.65%，CEL的加标回收率为86.38%~97.17%；标准曲线线性范围为CML 2.5~800 ng/mL和CEL 0.25~80 ng/mL，决定系数均大于0.999。

结论

该方法准确且灵敏，能够满足面包中AGEs的检测需求。

关键词

超高效液相色谱-串联质谱; 面包; 羧甲基赖氨酸; 羧乙基赖氨酸

晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end - products，AGEs）是蛋白质、脂类或核酸的自由氨基与还原糖的羰基发生非酶促反应，形成一系列化合物的总称^［

1］。目前研究较多的食源性AGEs主要有羧甲基赖氨酸（Carboxymethyl lysine，CML）、羧乙基赖氨酸（Carboxyethyl lysine，CEL）、甲基咪唑酮（Methyl imidazolidone，MG-H1）等^{［参考文献 2-3}2-3］，这些食源性AGEs的暴露与糖尿病、心脑血管疾病等一系列衰老和代谢相关性疾病的发生发展息息相关^{［参考文献 4-6}4-6］。

富含碳水化合物、脂肪和蛋白质的热加工食品是食源性AGEs的重要来源之一，也是目前该领域的研究热点^［

7-9］。面包作为典型的热加工食物，与其他食物种类相比，面包中AGEs含量处于相对较高的水平^{［参考文献 10

百度学术}10］。随着面包市场的扩大，我国各年龄人群通过进食面包摄入的食源性AGEs也在逐年增长。而建立简便且低成本的面包中AGEs含量检测方法是生产加工过程中抑制面包AGEs生成进而减少相应食源性AGEs暴露的重要基础。

目前国内外尚无食品中AGEs的限量或检测标准，文献报道的AGEs检测方法主要有酶联免疫吸附法、液相色谱-荧光检测法、气相色谱-质谱法及液相色谱-质谱法等^［

3，11-13］。酶联免疫吸附法虽然操作快速简便但易受基质干扰，特异性低；荧光检测法只能检测部分具有荧光特性的AGEs，灵敏度也较低；气相色谱-质谱法需衍生化，前处理复杂；而液相色谱-质谱法在具有较好分离效果的同时前处理也较为简便。

当前研究多使用液相色谱-质谱方法对生物或食物样品的AGEs进行定量^［

3］，并已有研究基于液质方法建立了西方膳食模式下食物AGEs的数据库^{［参考文献 2

百度学术}2，10］。但这些研究报道的方法多使用昂贵、繁琐且耗时的固相萃取法作为前处理基础，因此，本研究拟建立一套采用相对经济且简便的蛋白沉淀法作为前处理基础的超高效液相色谱-串联质谱（Ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）方法，以期实现对面包样品中蛋白结合型CML、CEL的定量检测。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

ZORBAX Eclipse Plus C₁₈色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、1200SL超高效液相色谱系统、6460三重串联四级杆质谱均购自美国Agilent Technologies，Waters OAsis HLB固相萃取小柱（1 cc/30 mg，30 µm，美国Waters），电子分析天平，Milli-Q超纯水仪（美国Millipore），KZ-III研磨仪，ALPHA1-4 LD plus冷冻干燥机（德国Christ）。

Na₂B₄O₇·10H₂O、NaBH₄、H₃BO₃、CH₂O₂、C₂H₄O₂、C₂HCl₃O₂、CHCl₃、HCl（分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司），C₂HO₂F₃（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司），CML、CML-d₂、CEL、CEL-d₄（分析纯，德国Iris Biotech GmbH），乙腈、九氟戊酸均为色谱纯。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

混合标准溶液：将2种AGEs标准溶液用超纯水分别稀释配制成10 μg/mL的标准储备液，用超纯水稀释配制成CML：2.5、5、10、20、50、100、200、400、800 ng/mL，CEL：0.25、0.5、1、2、5、10、20、40、80 ng/mL的混合标准曲线工作溶液。

混合内标溶液：将10 μg/mL的CML-d₂、CEL-d₄内标储备液以超纯水稀释并配制为CML-d₂：1 μg/mL，CEL-d₄：0.5 μg/mL的混合内标使用液。

1.2.2 面包样品前处理

取经冻干并粉碎的粉末状面包样品，加入去离子水进一步研磨后配制成0.05 g/mL的悬浊液，充分涡旋后取25 μL至7 mL玻璃管。加入500 μL含0.1 mol/L NaBH₄的硼酸盐（Na₂B₄O₇，0.05 mol/L）缓冲液（pH=9.2），静置2 h；加入2 mL -20 ℃预冷无水乙醇沉淀蛋白质，4 000 r/min低速离心10 min，弃上清液留沉淀，即只保留蛋白结合型AGEs；向沉淀中加入50 μL混合内标溶液（CML-d₂：1 μg/mL，CEL-d₄：0.5 μg/mL）、500 μL 6 mol/L盐酸，拧紧瓶盖后110 °C酸解18 h；酸解后80 °C氮吹至干，加入500 μL超纯水复溶，涡旋后转移至1.5 mL EP管，14 000 r/min离心10 min，取上清液200 μL于新1.5 mL EP管，80 °C下氮吹至干；加入400 μL 5 mmol/L九氟戊酸水溶液复溶，涡旋后14 000 r/min离心10 min，过0.22 μm滤膜后即为待测进样液。

1.2.3 仪器条件

色谱柱温：30 °C；流动相：乙腈（A相）和5 mmol/L九氟戊酸水溶液（B相），流速：0.25 mL/min，梯度洗脱流程：0~1 min，96%B；1~4 min，96%B→80%B；4~7 min，80%B→60%B；7~8 min，60%B→40%B；8~9 min，40%B→20%B；9~11 min，20%B；11~11.5 min，20%B→96%B；11.5~17 min，96%B。进样量：10 μL；质谱离子源：电离子喷雾，扫描模式：多反应监测；离子源温度：350 ℃，气流11 L/min，喷雾电压为4 000 V。定性离子对：CML：205.1→130.0，CEL：219.1→130.0；定量离子对：CML：205.1→84.1，CEL：219.1→84.0。

2 结果

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 前处理方法的选择

目前研究报道的蛋白结合型AGEs方法前处理一般采用固相萃取（Solid-phase extraction，SPE）法^［

14］，但SPE小柱价格较高，且萃取步骤繁琐而耗时较长，包括了活化、平衡、上样、淋洗、洗脱等步骤。有研究报道固相萃取法对极性较大的化合物纯化效果一般^{［参考文献 15

百度学术}15］。故针对极性较强的CML、CEL，本试验比对使用Waters Oasis HLB小柱的固相萃取法与使用-20 ℃预冷无水乙醇的蛋白沉淀法对面包样品进行前处理的效果，发现两种方法处理后CML、CEL的回收率均在方法学分析要求的±15%范围内，两种方法处理的样品在液相色谱图上基线均较平稳，在目标AGEs出峰的出峰时间段内基本无干扰杂峰；虽然固相萃取法在样品回收率及变异系数等方面优于蛋白沉淀法，但在引入同位素内标后，低、中、高AGEs水平的面包样品经两种方法处理后的定量结果差异无统计学意义（P>0.05），详见表1。即采用简便且经济的蛋白沉淀法作为前处理方法同样可以实现对面包样品中两种蛋白结合型AGEs的定量检测。

表 1 固相萃取法及蛋白沉淀法定量结果比较（n=3）

Table 1 Comparison of quantitative results between solid phase extraction and protein precipitation (n=3)

目标物	样品编号	固相萃取法/（mg/kg）		蛋白沉淀法/（mg/kg）		显著性
目标物	样品编号	定量结果	SD	定量结果	SD	显著性
CML	1	6.37	0.53	5.14	0.67	—
	2	23.46	1.32	20.91	1.17	—
	3	42.60	2.56	39.77	3.02	—
CEL	1	2.78	0.30	2.39	0.35	—
	2	25.17	1.77	27.98	2.51	—
	3	43.72	1.38	43.79	3.40	—

注： SD：标准差；—：P＞0.05

2.1.2 蛋白沉淀试剂的选择

分别取甲醇-乙腈（1∶3，V/V）混合溶液、三氯乙酸、丙酮、盐酸（6 mol/L）、三氯甲烷、-20 ℃预冷无水乙醇各2 mL作为蛋白沉淀试剂，对面包混合样品进行前处理并上机检测，试验溶液AGEs浓度为CML 437.13±20.36 ng/mL、CEL 442.52±21.30 ng/mL。以CML、CEL峰面积即响应值作为指标比较，试验重复3次。结果见表2，从CML、CEL响应值大小看，-20 ℃预冷无水乙醇沉淀蛋白质的效果明显好于三氯乙酸、丙酮、盐酸、三氯甲烷等试剂，略优于甲醇-乙腈（1∶3，V/V）混合溶液，故选择-20 ℃预冷无水乙醇作为本试验前处理的蛋白沉淀试剂。

表2 6种蛋白沉淀试剂比较结果（n=3）

Table 2 Comparison results of 6 kinds of protein precipitation reagents (n=3)

沉淀试剂	CML		CEL
沉淀试剂	响应值	SD	响应值	SD
甲醇-乙腈（1:3，V/V）	5 269 328.33	264 550.60	5 300 196.33	339 315.71
三氯乙酸	4 481 195.66	283 194.16	4 569 539.00	325 836.68
丙酮	4 375 279.00	383 987.48	4 927 684.33	308 451.74
盐酸（6 mol/L）	3 578 098.66	520 278.00	3 809 690.66	433 907.63
三氯甲烷	4 467 133.66	402 073.07	4 767 240.00	132 061.57
-20 ℃预冷无水乙醇	5 565 120.00	197 735.13	5 321 281.66	222 271.39

注：响应值：化合物在质谱图中的峰面积；SD：标准差

2.1.3 离子对试剂的考察

本试验比较了0.5、1、2、5、8 mmol/L浓度的三氟乙酸、甲酸、乙酸及九氟戊酸水溶液作为复溶液及水相的效果，试验混合标准溶液AGEs浓度为CML 50 ng/mL、CEL 5 ng/mL。结果发现5 mmol/L的九氟戊酸水溶液作为复溶液及水相取得了较理想的保留时间、分离效果及色谱峰型。25 ℃气温条件下pH计检测5 mmol/L九氟戊酸的pH值为2.33~2.35，在C₁₈色谱柱耐受的pH值范围2~8内。故采用5 mmol/L的九氟戊酸水溶液作为复溶液及水相（B相）。研究建议梯度洗脱流程以高水相开始而低水相结束可以减少有机盐或亲脂性有机物在色谱柱中的沉积而延长色谱柱的寿命^［

16］，故为了提高CML、CEL的分离度，减少拖尾改善峰形，提高柱效，最终确定的梯度洗脱流程如下：0~1 min，96%B；1~4 min，96%B→80%B；4~7 min，80%B→60%B；7~8 min，60%B→40%B；8~9 min，40%B→20%B；9~11 min，20%B；11~11.5 min，20%B→96%B；11.5~17 min，96%B。

2.1.4 CML、CEL的典型色谱图

空白样品、加标空白样品（加标浓度CML：20 ng/mL，CEL：2 ng/mL）以及面包样品的典型色谱图见图1，各色谱峰型良好，实际样品中CML、CEL的保留时间分别为8.49、8.96 min，空白样品对应的出峰时间无明显内源性干扰存在。

图1 UPLC-MS/MS典型色谱图

Figure 1 Typical chromatograms of UPLC-MS/MS

注：空白样品（A1：CML；B1：CEL），加标空白样品（A2：CML；B2：CEL），面包样品（A3：CML；B3：CEL）

2.2 基质效应的评价

取烘焙温度150 ℃、烘焙时间8 min的面包芯样品，按前处理方法从添加内标步开始处理成待测进样液，将其稀释1倍后上机检测结果为低于检出限，取该稀释后的待测进样液作为空白基质溶液，并建立基质匹配标准曲线，与溶剂标准曲线进行比较。CML、CEL的基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线斜率比值为0.83、0.81（超出1±0.15范围），面包基质会在一定程度上限制目标AGEs的离子产生。在两种标准曲线中加同位素内标后发现斜率比值为0.91、0.96，即在加入同位素内标后可以忽略面包基质对目标化合物电离的影响，因此采用制作较简便的加入同位素内标的溶剂标准曲线进行定量。

2.3 方法检出限、定量限、标准曲线、回收率

方法检出限、定量限根据加标空白样检测信号信噪比为3和10的浓度确定，即CML 4.5、20 ng/g；CEL 0.5、2 ng/g。与其他使用液质方法检测面包AGEs的研究相比^［

17-18］，本研究的检出限及定量限均较低。CML标准曲线的9个浓度点为2.5、5、10、20、50、100、200、400、800 ng/mL，浓度点范围内线性良好，线性方程：y=0.022 444x+0.132 779，决定系数R²>0.999；CEL标准曲线的9个浓度点为0.25、0.5、1、2、5、10、20、40、80 ng/mL，浓度点范围内线性良好，线性方程：y=0.048 061x-0.010 915，决定系数R²>0.999。空白基质溶液加低、中、高浓度标的结果见表3，其中CML的平均回收率为89.62%~95.65%，相对标准偏差（RSD）为4.14%~10.75%，CEL的平均回收率为86.38%~97.17%，RSD为6.39%~9.92%。

表 3 CML、CEL的加标回收率及相对标准差（n=6）

Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of CML and CEL (n=6)

目标物	加标量/ (ng/mL)	实测值/(ng/mL)	回收率/%	RSD/%
	5	4.48	89.62	10.75
CML	50	47.82	95.65	4.14
	500	452.38	90.48	8.40
	0.5	0.43	86.38	7.55
CEL	5	4.86	97.17	6.39
	50	46.47	92.93	9.92

2.4 实际样本测定

酵母添加量1%、糖20%、油8%，烘焙温度为190 ℃，烘焙时间为20 min条件制成的6个面包样品检测结果显示，面包皮中结合型CML、CEL平均含量为33.69±2.95、30.42±1.31 mg/kg，面包芯中结合型CML、CEL平均含量为7.56±0.83、1.33±0.09 mg/kg。

3 小结

本试验建立了基于蛋白沉淀法检测面包中两种蛋白结合型AGEs的UHPLC-MS/MS方法。与固相萃取法相比，本试验前处理采用了以-20 ℃预冷无水乙醇作为蛋白沉淀试剂的蛋白沉淀法，在能满足方法学要求的同时还具有操作简便、耗时短、经济等特点。使用同位素内标CML-d₂、CEL-d₄很好地解决了面包基质效应的问题，同时优化了色谱方法以提高对CML、CEL定量的准确性。本试验所建立的检测方法具有简便、经济、准确可靠的特点，适用于面包样品中蛋白结合型CML、CEL的定量检测。

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