摘要
对事件采集的样本经FilmArray多重PCR系统进行快速初筛，同时进行细菌分离培养鉴定。使用PCR检测技术对分离菌株进行毒力基因检测，采用16S rRNA基因序列分析与PFGE分型方法对分离菌株进行同源性分析。
2份患者肛拭子样本和4份食堂厨工肛拭子样本检出空肠弯曲菌，检出菌株均携带flaA、cadF、imaA、cdtA、cdtB、cdtC等毒力基因。16S rRNA基因序列分析表明6株分离菌株均为空肠弯曲菌，1株菌株与其他5株菌株分子发育距离稍远。6株菌株经PFGE分型可分为3种带型，3株菌和2株菌分别呈现同一带型，2种带型相似性为52.2%；另1株菌为另一带型，与其他菌株带型相似性仅为26.7%。
空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni， C.jejuni）是常见的人畜共患病病原菌，可引起急性胃肠炎和食物中毒，造成腹痛、水泻、血便、发烧、恶心、呕吐等不同程度的病症，多为自限性疾病，人群中各个年龄段均易
2021年3月，中山市某学校发生一起疑似食源性疾病的暴发事件，患者出现腹泻、腹痛、发热、呕吐等胃肠道症状，通过现场流行病学调查及实验室检测和病原分析，证实本次暴发是由空肠弯曲菌感染引起的。本研究对空肠弯曲菌分离株进行毒力基因检测，并采用16S rRNA基因分型及脉冲场凝胶电泳（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分型等两种方法对菌株进行分子分型溯源。
FilmArray多重PCR系统（法国生物梅里埃公司）；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectromenter，MALDI-TOF-MS）（德国BRUKER公司）；CFX96 Real-Time PCR仪、Gel Doc XR+凝胶成像仪、CHEF MAPPER XA脉冲场电泳仪（美国Bio-Rad公司）；QIAxcel Advanced毛细管电泳仪（德国Qiagen公司）；ANOXOMAT MARK II厌氧微需氧培养系统（荷兰MART公司）。
胃肠道感染测试条（法国生物梅里埃公司）；双孔滤膜法弯曲菌检测试剂盒（青岛中创公司）；哥伦比亚血平板（郑州博赛公司）；空肠弯曲菌核酸检测试剂盒（深圳生科原公司）；API Campy生化鉴定条和相关添加试剂（法国生物梅里埃公司）；限制性内切酶SmaI和XbaI（美国New England Biolab公司）；DNA提取试剂盒Wizar
患者肛拭样本采用FilmArray多重PCR系统的胃肠道感染测试条进行22种常见胃肠道病原快速筛查，包括13种细菌（弯曲菌属Campylobacter、难辨梭菌毒素Clostridium difficile toxin A/B 、类志贺邻单胞菌Plesiomonas shigelloides、沙门菌属Salmonella、弧菌属Vibrio、霍乱弧菌Vibrio cholerae、小肠结肠耶尔森菌Yersinia enterocolitica、致泻大肠埃希氏菌/志贺菌Diarrheagenic Escherichia coli/Shigellan 6种）、5种病毒（腺病毒Adenovirus F组40/41、星状病毒Astrovirus、诺如病毒Norwalk viruses G/G、轮状病毒Rotavirus A群、札如病毒Sapovirus）、4种寄生虫（隐孢子虫Cryptosporidium parvum、环孢子虫Cyclospora、痢疾阿米巴Entamoebahistolytica、兰伯氏贾第鞭毛虫Giardia lamblia）。
采用荧光定量PCR方法对患者肛拭子、食堂厨工肛拭子、食堂制作加工环境拭子以及食品样本进行空肠弯曲菌和结肠弯曲菌核酸检测。
参照国标GB4789系列、WS/T 9—1996和WS 271—2007对本事件采集的患者肛拭子、食堂厨工肛拭子和食堂制作加工环境拭子样本进行沙门菌、致泻大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌Vibrio parahemolyticus、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus、变形杆菌Proteus分离培养。依据国标GB4789和WS/T 9—1996对食品样本进行沙门菌、致泻大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、变形杆菌分离培养。
参照WS 271—2007和《2021年国家食品污染和有害因素风险监测工作手册》方法，采用弯曲菌检测试剂盒（双孔滤膜法）分离培养空肠弯曲菌，42 ℃微需氧（5% O2， 10% CO2， 85% N2）培养48 h。挑取可疑菌落分离纯化后进行生化鉴定，并采用荧光定量PCR方法和MALDI-TOF-MS进行菌株鉴定。
空肠弯曲菌分离株经42 ℃微需氧纯培养过夜，使用细菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA，置于-20 ℃保存备用。对菌株进行10种毒力基因（fla
| 基因名称 | 引物序列（5’→3’） | 产物长度/bp | PCR反应程序 |
|---|---|---|---|
| flaA | F:GGATTTCGTATTAACACAAATGGTGC | 1 728 | 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 1 min, 52 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 35 cycles; 72 ℃ 10 min |
| R:CTGTAGTAATCTTAAAACATTTTG | |||
| cadF | F:TGGAGGGTAATTTAGATATG | 400 | 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 1 min, 52 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 35 cycles; 72 ℃ 10 min |
| R:CTAATACCTAAAGTTGAAAC | |||
| pldA | F:AAGCTTATGCGTTTTT | 913 | 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 1 min, 52 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 35 cycles; 72 ℃ 10 min |
| R:TATAAGGCTTTCTCCA | |||
| virB11 | F:GAACAGGAAGTGGAAAAACTAGC | 708 | 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 1 min, 52 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 35 cycles; 72 ℃ 10 min |
| R:TTCCGCATTGGGCTATATG | |||
| ciaB | F:TTTTTATCAGTCCTTA | 986 | 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 1 min, 52 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 35 cycles; 72 ℃ 10 min |
| R:TTTCGGTATCATTAGC | |||
| imaA | F:GCACAAAATATATCATTACA | 518 | 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 1 min, 52 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 35 cycles; 72 ℃ 10 min |
| R:TTCACGACTACTATGAGG | |||
| cdtA | F:CCTTGTGATGCAAGCAATC | 370 | 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 1 min, 52 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 35 cycles; 72 ℃ 10 min |
| R:ACACTCCATTTGCTTTCTG | |||
| cdtB | F:GTTAAAATCCCCTGCTATCAACCA | 495 | 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 1 min, 52 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 35 cycles; 72 ℃ 10 min |
| R:GTTGGCACTTGGAATTTGCAAGGC | |||
| cdtC | F:TGGATGATAGCAGGGGATTTTAAC | 555 | 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 1 min, 52 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 35 cycles; 72 ℃ 10 min |
| R:TTGCACATAACCAAAAGGAAG | |||
| wlaN | F:TTAAGAGCAAGATATGAAGGTG | 672 | 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 1 min, 52 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 35 cycles; 72 ℃ 10 min |
| R:CCATTTGAATTGATATTTTTG |
通过选取16S rRNA基因通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）对所提取的DNA进行PCR扩增。反应体系为50 μL：上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，Premix Ta
6份患者肛拭子、27份食堂厨工肛拭子、8份食堂制作加工环境拭子和26份食品均未检出沙门菌、致泻大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、变形杆菌。
患者肛拭混合样经22种常见胃肠道病原快速筛查显示弯曲菌属（空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌）核酸阳性。3份患者肛拭子和5份食堂厨工肛拭子空肠弯曲菌核酸阳性。
2份患者肛拭子样本（编号CJYQ-30、CJYQ-31）和4份食堂厨工肛拭子样本（编号CJYQ-01、CJYQ-02、CJYQ-14、CJYQ-16）在哥伦比亚血平板和Karmali平板上呈现疑似菌落。生化鉴定，荧光定量PCR和MALDI-TOF-MS检测结果见
| 菌株编号 | API | MALDI-TOF-MS | RT-PCR |
|---|---|---|---|
| CJYQ-01 | C.jejuni （99.2%） | C.jejuni 2.15 | C.jejuni（+） |
| CJYQ-02 | C.jejuni （95.2%） | C.jejuni 2.24 | C.jejuni（+） |
| CJYQ-14 | C.jejuni （98.0%） | C.jejuni 2.12 | C.jejuni（+） |
| CJYQ-16 | C.jejuni （99.2%） | C.jejuni 2.10 | C.jejuni（+） |
| CJYQ-30 | C.jejuni （95.2%） | C.jejuni 2.17 | C.jejuni（+） |
| CJYQ-31 | C.jejuni （99.2%） | C.jejuni 2.15 | C.jejuni（+） |
6株菌株毒力基因flaA、cadF、imaA、cdtA、cdtB、cdtC均为阳性，毒力基因pldA、virB11、ciaB、wlaN均为阴性，见
图1 空肠弯曲菌毒力基因PCR产物毛细管电泳图
Figure 1 Capillary electropherogram of PCR product of virulence gene of Campylobacter jejuni
通过测序获得6株空肠弯曲菌的16S rRNA基因序列，在NCBI上进行比对和同源性分析， 显示与空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）高度相似性（99.93%以上）。选取3个与本研究菌株相似性较高的序列，以结肠弯曲菌（Campylobacter coli）、胎儿弯曲菌（Campylobacter fetus）、海鸥弯曲菌（Campylobacter lari）等序列作为外群序列，应用MEGA6.0绘制的基于Neighbor-Joining法系统发育树见
图2 基于16S rRNA基因序列应用Neighbor-Joining法构建的系统发育树
Figure 2 The phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequence using Neighbor-Joining method
本研究分离的6株空肠弯曲菌经PFGE聚类分析，可分为3种PFGE带型，见
图3 6株空肠弯曲菌PFGE聚类分析图
Figure 3 The PFGE cluster results of 6 Campylobacter jejuni strains
空肠弯曲菌感染引起的暴发事件在国内报道较少，该菌培养条件苛刻且培养时间较长，目前国标检测方法仍以传统分离培养技术为主，检测时间长、检出率较低而不适于暴发事件的快速检测。本研究中，以FilmArray检测系统筛查多种常见胃肠道病原，快速锁定目标病原菌；采用双孔滤膜培养技术及荧光定量PCR和MALDI-TOF-MS鉴定技术成功从采集样本中分离出空肠弯曲菌，结合流行病学调查、病例临床症状、实验室检测分析，证实这是一起空肠弯曲菌引起的食源性疾病事件。
尽管目前对空肠弯曲菌的致病机制尚未十分明确，但许多研究证实细菌的黏附、侵袭、鞭毛活动力、毒素的产生等与该菌相关毒力基因相关。菌株携带毒力基因flaA在空肠弯曲菌的致病过程中有重要作
菌株的分子分型在病原体传播途径的流行病学研究中起着重要的作用。目前，基于细菌染色体DNA分析的PFGE方法具有分辨率高、重复性好、结果稳定的优点，已经成为细菌分子分型技术的“金标准”。PFGE已被广泛用于空肠弯曲菌的分子流行病学研究，被普遍认为是对弯曲菌进行分型的最具鉴别能力的基因分型方法之
16S rRNA为普遍存在于原核生物的一种核糖体RNA，是微生物进行鉴定和分型的最好标志物。随着测序技术不断发展，16S rRNA基因序列分析与分子生物学技术结合已实现微生物的鉴定、分型及溯
由此可见，对于本起事件6株空肠弯曲菌分离株分型结果显示，16S rRNA基因序列分析法和PFGE分型方法结果一致，两个方法分辨率相当，并从分子水平上提示本起事件是由不同克隆株的空肠弯曲菌感染所致。
空肠弯曲菌引起人类腹泻潜伏期长，一般为1~10
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