为完成对牛乳中生物胺开展在线检测的研究，研究并建立适用的快速检测技术，且检测装置要尽可能小型化、分析过程尽可能简便和快速，以适应现场检测的需
当前国内外针对牛乳无生物胺的相应规定，乳制品中生物胺的种类及总量可能与生长条件、保存天数、加工工艺以及与微生物水平密切相关，致使各类产品差别较
目前，在快速检测方法方面主要是针对水产品、肉制品中组胺的快速检测试纸条、分子印迹技术以及表面拉曼光
微型紫外-可见分光光度计（安谱公司），分析天平（0.001 g，瑞士梅特勒-托利多公司）。
盐酸（质量分数37%，分析纯，国药试剂），碳酸钠（色谱纯，CNW），对硝基苯胺（分析纯，阿拉丁），亚硝酸钠（分析纯，CNW），组胺二盐酸盐（histamine dihydrochloride，纯度>99.0%）、酪胺（tyramine，纯度>98%）标准品（CNW）。
甲液（对硝基苯胺）：称取0.5 g对硝基苯胺，加5 mL盐酸溶液溶解后转移至200 mL容量瓶中，再用水定容至刻度。置冰箱中，临用现配。
乙液（亚硝酸钠溶液）：称取0.5 g亚硝酸胺，加入100 mL水溶解，临用现配。
实验前，吸取5 mL甲液、40 mL乙液混合，即为偶氮试剂，临用现配。
取酪胺储备液（2 mg/mL）50、100、250、375、500 µL置于50 mL离心管中，组胺标准品储备液（5 mg/mL）20、40、100、150、200 µL置于另一组50 mL离心管中，各分别加入牛乳阴性样品至10 mL，混匀，分别得到酪胺和组胺10、20、50、75、100 µg/mL的标准曲线溶液。再加入20 mL盐酸溶液（1：11），在60 ℃水浴中放置30 min，其间不时取出混匀。5 000 r/min离心5 min，取上清液过0.45 μm滤膜。取滤液1 mL置于15 mL离心管中，加入3 mL 50 g/L碳酸钠溶液，3 mL偶氮试剂，3 mL水，在混匀后10~15 min间上机检测。
目前无专门适用于牛乳检测的前处理方法。如参照GB 5009.208—2016中丹磺酰氯衍生的方法，衍生后10 min发现不同加标浓度的溶液颜色由浅黄色均变成棕红色，且不成线性；如参照GB 5009.208—2016中偶氮试剂衍生的方法，则存在样品轻微浑浊、基质标准曲线线性差、RSD值偏大等问题，故目前最常见的这两种方法均不适用于牛乳样品前处理。
根据检测原理分析，偶氮试剂衍生方法更适合牛乳中生物胺的显色，但必须建立针对性前处理方法。为此，以GB 5009.208—2016为基础，分别进行酸化、提取、去除杂质等优化研究，优化前后前处理条件对比见
| GB 5009.208—2016 | 优化后的方法 | |
|---|---|---|
| 酸化条件 | 20 mL 10%三氯乙酸 | 20 mL 1∶11盐酸 |
| 提取条件 | 浸泡2~3 h | 60 ℃水浴，30 min |
| 去除蛋白质等 | 振荡2 min，滤纸过滤 | 离心5 min |
| 萃取条件 | 正戊醇提取3次，盐酸萃取 | — |
图1 操作流程图
Figure 1 Operation flow chart
考虑到以往常用的三氯乙酸存在腐蚀性以及后续衍生化中使用盐酸的实际特点，故选择盐酸作为酸化试剂。按照后续确定的前处理步骤，选择1∶11盐酸是最适合的，实际检测中在组胺和酪胺添加水平10 mg/kg时回收率均可达95%左右，盐酸浓度过低时会影响去除蛋白的效果，但浓度过高时似乎会导致牛乳分解，存在干扰，致使结果异常高。
以添加水平为10 mg/kg进行提取效果比较，浸泡2~3 h的提取效率仅70%左右，当60 ℃水浴放置15 min时提取效率接近80%，但60 ℃水浴放置30 min的提取效率则在90%以上，故选择后者。
在偶氮试剂衍生方法研究中，通过观测组胺、酪胺在偶氮染色过程中波长与所对应的吸光度随时间变化的三维图，如
图2 组胺吸光度变化与时间关系图
Figure 2 Relationship between histamine absorbance change and time
图3 酪胺吸光度变化与时间关系图
Figure 3 The relationship between tyramine absorbance change and time
定性由检测浓度对应的最大吸收波长决定，由于浓度变化而导致峰型有所变化，故最大吸收波长可能表观上存在差异。在浓度为50 mg/kg时，组胺的最大吸收波长在（460±30） nm之间，酪胺的最大吸收波长在（515±5） nm之间。通过使用标准品测试可以看到在此条件下可能产生干扰的生物胺有苯乙胺、精胺、亚精胺，由于酪胺和组胺的吸收在可见光区显著优于其他生物胺、且实际牛乳筛查及文献报道中并未提及可能会存在这三种生物胺，故该波长下牛乳中其他生物胺等存在干扰的现象几乎不存在。定量采用标准曲线外标法定量。
取3种市场主流品牌牛乳样品，在确定其组胺和酪胺均低于检出限后添加组胺、酪胺标准溶液，使浓度分别为10、20、50、75、100 mg/L，然后在完成前处理后进行检测，以分析物的浓度与对应的吸光度差值（最大吸光度与基线吸光度）比值绘制校正曲线，按外标法计算试样中组胺与酪胺的含量。如
| 化合物 | 线性方程 | 线性范围/（mg/L） | LOQ/（mg/kg） | |
|---|---|---|---|---|
| 组胺 | y=0.002 8x-0.000 9 | 10~100 | 0.998 9 | 10 |
| 酪胺 | y=0.001 7x-0.000 4 | 10~100 | 0.995 3 | 10 |
由于鲜牛乳未经发酵，故组胺和酪胺本身含量很低，以限量值要求的50 mg/kg和定量限10 mg/kg分别作为加标浓度，通过向空白鲜牛乳样品基质中添加组胺和酪胺，以确定方法的准确度和精密度。结果见
| 加标浓度 | 日内稳定性 | 日间稳定性 | |||
|---|---|---|---|---|---|
| 组胺 | 酪胺 | 组胺 | 酪胺 | ||
| 50 mg/kg | 平均值/（mg/kg） | 48.22 | 51.18 | 47.08 | 47.47 |
| 精密度/% | 2.48 | 2.03 | 4.34 | 4.28 | |
| 10 mg/kg | 平均值/（mg/kg） | 9.73 | 9.67 | 9.54 | 9.66 |
| 精密度/% | 3.18 | 3.36 | 5.37 | 5.22 | |
本研究建立的方法组胺和酪胺的定量限均为10 mg/kg，而当前国内外最低的限量要求为50 mg/kg，实现了牛乳组胺和酪胺的快速检测。本方法在节省时间的同时，也大大减少了过程中消耗的试剂，特别是避免了腐蚀性试剂的使用。
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