摘要
病原菌的分离和鉴定参照GB/T 4789.29—2003，同时采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对病原菌种类进行鉴定。采用超高效液相色谱-复合线性离子阱串联质谱技术（UPLC-QTRAP-MS/MS）对黑木耳以及患者血液、肝脏和尿液、菌悬液等样品中的米酵菌酸进行检测。
在残留食材黑木耳、患者血液和尿液中均检出不同浓度的米酵菌酸。患者中毒5 d后进行了肝移植，坏死的肝脏中检出高浓度米酵菌酸。患者中毒9 d后，跟踪监测显示患者血液、尿液中仍然含有一定浓度的米酵菌酸。从患者采摘的干木耳及泡发的湿木耳中均分离出唐菖蒲伯克霍尔德菌，经实验室培养后，两株菌株均产出米酵菌酸。
关键词
米酵菌酸（Bongkrekic acid， BA），IUPAC命名为（2E， 4Z， 6R， 8Z， 10E， 14E， 17S， 18E， 20Z）-20-（羧甲基）-6-甲氧基-2， 5， 17-三甲基-2， 4， 8， 10， 14， 18， 20-廿二碳七烯二酸，是一种热稳定、高不饱和的三羧酸脂肪酸。米酵菌酸是唐菖蒲伯克霍尔德菌［Burkholderia gladioli （Severini 1913）］的次生代谢产物，是一种线粒体毒素，其主要的靶器官是肝脏、大脑和肾
米酵菌酸致死率高， 1975年以来，在印度尼西亚，食用米酵菌酸污染的酵椰饼（发酵椰奶制品）已导致近3 000例BA中毒，平均死亡率为60
米酵菌酸中毒病情凶险，患者一般很快转入ICU进行抢救，给各方带来巨大压力。为快速确证中毒原因，并协助医院进行诊断和抢救，现报告一起黑木耳中毒事件及调查过程，为疾病预防控制中心专业人员调查处置提供借鉴和参考。
2019年8月28日，深圳市某患者进食已浸泡3 d的黑木耳后出现腹泻，墨绿色稀水样便，每数分钟排一次大便，伴有恶心，自服“益生菌”治疗。29日，患者腹泻减轻，恶心、呕吐加重，呕吐次数增加，伴乏力、口干，遂就诊。血常规检查：总胆红素92.05 μmol/L（正常参考值5.13～22.24 μmol/L）；谷丙转氨酶2 671 U/L（正常参考值0～40 U/L）；谷草转氨酶2 246 U/L（正常参考值0～40 U/L）；乳酸脱氢酶3 330 U/L（正常参考值≤252 U/L）；羟丁酸脱氢酶1 367 U/L（正常参考值90～182 U/L），以急性肝功能损害为主要特点，流行病学调查确定黑木耳为高危暴露食品。
患者曾采摘一大袋黑木耳并晒干，取部分干木耳泡发3 d。泡发好的黑木耳未全部烹饪，剩余部分湿木耳。采集上述干木耳和湿木耳样品，以及患者入院后的血液和尿液样品。患者中毒5 d后进行了肝移植，置换下来的坏死肝脏用于进行BA检测研究。患者中毒9 d后，跟踪监测采集患者血液。干、湿木耳用于后续菌的分离。
AB SCIEX QTRAP 5500超高效液相色谱-复合线性离子阱串联质谱（美国AB） 、岛津shim-pack XR-ODS色谱柱（1.7 μm，2.0 mmi·d×75 mm，日本岛津）、Sigma 3-18KS离心机（德国Sigma）、IKA T25组织匀浆机（德国IKA公司）、布鲁克微生物快速鉴定系统（Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight， MALDI-TOF MS、德国Bruker Daltonics公司）、MALDI-TOF Vitek MS全自动快速微生物质谱检测系统（法国梅里埃）、VITEK2 COMPACT微生物生化鉴定仪和GN鉴定卡（法国梅里埃）、BluePard BPH9272精密恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。
米酵菌酸标准品（上海安谱实验科技股份有限公司，Lot：Z3940030，浓度1.0 mg/mL in Tris），甲醇、乙腈均为色谱纯（美国Fisher），乙酸购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。GVC增菌液、马铃薯葡萄糖琼脂、马铃薯葡萄糖半固体琼脂、卵黄平板、SS平板等均购自广东环凯微生物科技有限公司。
取木耳样品1 g，加入20 mL GVC增菌液，36 ℃培养48 h后，划线接种于PDA平板，36 ℃培养24 h。对革兰染色阴性和氧化酶试验阴性的菌落再点种卵黄琼脂平板和SS琼脂平板，36 ℃分别培养48 h和24 h，观察菌落特征。
对纯培养菌株进行革兰染色，严格按照Vitek 2 Compact系统操作程序及GN细菌鉴定卡说明书进行操作。首先挑取纯培养菌落，用0.45%无菌氯化钠溶液配制成相应浊度的菌悬液，然后应用相应卡片上机鉴定。
GB 5009.189—2016《食品安全国家标准 食品中米酵菌酸的测定》，需要固相萃取或反复的液-液萃取，而且采用定性能力不强的紫外检测方法（吸收波长267 nm），无法满足临床和应急检测的实际需求。本研究采用液质方法对BA进行定性和定量检测，同时考虑到食物中毒检测的紧急性，以及中毒诊断与抢救的迫切性，参照广东省疾病预防控制中心以及美国FDA技术人员在BA中毒调查中的检测方
超市购买的新鲜湿木耳（阴性对照），剪碎后混匀，称取约5 g（精确至0.01 g），加入40 mL甲醇，均质，超声4 min，10 000 r/min离心10 min，取上清过0.2 μm滤膜后，液质上机测定BA含量。
按上述流程处理湿木耳样品，过0.2 μm滤膜，滤液再用甲醇稀释500倍后，液质上机测定BA含量。
血液：取1.0 mL血清，加入4 mL甲醇，振荡5 min，超声5 min，10 000 r/min离心10 min，取上清过0.2 μm滤膜，进样分析。尿液：取5 mL尿液，加入5 mL甲醇，按上述方法振荡，超声，离心，取上清过膜后进样分析。肝脏：取患者肝脏约0.5 g（精确至0.01 g），加入5 mL甲醇，均质，超声，离心，取上清过膜后进样分析。
流动相A相：0.2%乙酸；B相：乙腈+0.2%乙酸。梯度：0～2 min， 20%B；2～8 min，20%B→100%B；8～10 min，100%B→20%B；10～12 min，20%B。流速：300 μL/min；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL。
按1.2.1进行增菌和分离，挑取可疑菌落接种至PDA平板纯培养，再挑取单菌落做生化和生物质谱鉴定，鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌后，取已鉴定的菌落划线接种至PDA斜面，36 ℃培养48 h。取适量菌落至生理盐水，制备1MCF菌悬液。取0.5 mL菌悬液，加入4.5 mL甲醇，振荡，超声，离心，过0.2 μm滤膜，液质上机测定BA含量。
本次调查中，实验室收到血、尿及食物样品后，1.5 h内确证样品中含有高浓度BA。其中，湿木耳中BA含量高达1.25 mg/g，血清中BA含量高达450.8 ng/mL，尿液中BA含量为7.04 ng/mL，上述结果反馈为调查和临床抢救迅速指明方向。此外，中毒5 d后，患者进行了肝移植，坏死肝脏提取液中BA含量达79 ng/mL。中毒9 d后，跟踪监测患者血液，BA浓度下降至137.7 ng/mL，上述检测结果为治疗方案提供数据。分离自干木耳和湿木耳中的唐菖蒲伯克霍尔德菌菌株，36 ℃培养48 h后（见1.2.4.1），1MCF（麦氏浊度）菌悬液中BA含量分别为7 387 ng/mL和6 977 ng/mL。继续产毒培养（见1.2.4.2），26 ℃培养5 d，冻融液中BA含量分别为1 018 ng/mL和907 ng/mL，确证木耳中唐菖蒲伯克霍尔德菌产毒是本次中毒事件的根源，部分样品的液质图谱如
图1 标准溶液（a）、黑木耳样品（b）、患者肝脏样品（c）及菌悬液样品（d）中米酵菌酸和异米酵菌酸的TIC图
Figure 1 Tic diagram of bongkrekic acid and iso bongkrekic acid in standard solution (a), Auricularia auricula sample (b), patient liver sample (c) and bacterial suspension sample (d)
从干木耳和湿木耳中分离的可疑菌株，在PDA平板上呈现湿润、光滑的凸起，接种至PDA半固体培养基培养1周可见黄色素扩散。在卵黄平板斜射日光下可见菌落周围呈虹彩现象，菌落有沉淀环，沉淀环外有半透明圈；在SS平板上不生长。
挑取少量菌苔，进行生化试验。鉴定结果显示，从干木耳中分离的可疑菌株93%概率为唐菖蒲伯克霍尔德菌，从湿木耳中分离的可疑菌株94%概率为唐菖蒲伯克霍尔德菌。
对干木耳和湿木耳中分离的可疑菌株进行生物质谱鉴定，布鲁克微生物快速鉴定系统鉴定结果显示，分值2分以上的鉴定结果均为唐菖蒲伯克霍尔德菌，其中分值最高为Burkholderia gladioli DSM 8361 DSM标准菌株（分值2.176）。Vitek MS全自动快速微生物质谱检测系统的检测结果与Bruker Biotyper系统一致，干木耳和湿木耳中分离的可疑菌株均为唐菖蒲伯克霍尔德菌。
考虑到米酵菌酸的体内数据极为少见，人体毒代动力学特征尚不清楚。本次调查初步推测米酵菌酸的体内过程，如
图2 患者泡发的木耳（a）、患者血液（b和e）、尿液（c）及肝脏（d）中米酵菌酸含量
Figure 2 The content of MIC acid in Auricularia auricula (a), blood (b and e), urine (c) and liver (d)
患者体质量约60 kg，以4 000 mL血量计，血清中BA浓度为450.8 ng/mL，血中BA总量约为1.8 mg，只占摄入量（60 mg）的3%。同时，BA的清除速率并不迅速，进食51 h后，血清中BA浓度为450.8 ng/mL，进食218 h后，血中BA仍有137.7 ng/mL。因此，推测BA具有相当大的表观分布容积，BA摄入后，广泛分布于人体器官。笔者调查的多名BA中毒患者出现肝、肾、脑等多器官衰竭，也印证了BA分布的广泛性。
此外，进食51 h后，尿中BA浓度（7.04 ng/mL）仅为血中BA浓度（450.8 ng/mL）的1.56%，提示BA极少以原型排泄，应急检测中尿液不是理想的样本。
近年来，米酵菌酸引发的群体性食物中毒事件频发，米酵菌酸致死率高，可污染食物种类众多，如椰奶制品、玉米制品（酵米面
本次调查先以液质技术为手段，迅速确证患者为米酵菌酸中毒，并协助临床抢救患者。同时，采用生化鉴定和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）等手段确证从干木耳和湿木耳中分离出唐菖蒲伯克霍尔德菌。最后，再次用液质技术测定2个菌株在实验室条件下所产的米酵菌酸，证明均为产毒株。
唐菖蒲伯克霍尔德菌可污染食物种类众多，而该菌在土壤和植物等自然环境中普遍存
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