摘要
以两色金鸡菊（水提取物）为受试物，采用细菌回复突变试验、小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验（MLA）分别在代谢活化（+S9）和非代谢活化（-S9）条件下检测；以两色金鸡菊（粉末）为受试物，采用小鼠骨髓微核试验检测。细菌回复突变试验采用平板掺入法，检测1.25、2.5、5、10 mg/皿4个剂量诱发鼠伤寒沙门氏菌TA98、TA100、TA1535、TA1537及大肠杆菌WP2uvrA的hi
+、-S9条件下，1.25~10 mg/皿（生药剂量8.33~66.67 mg/皿）诱发5株测试菌的回变菌落数与灭菌注射用水阴性（溶媒）对照比较，无明显增加；1.5~3.5 mg/mL（生药浓度10~23.33 mg/mL）诱发的MF明显增加并具有浓度相关性，+S9条件下的3.0、3.5 mg/mL浓度组诱发的T-MF、S-MF达到阴性对照组的3倍以上，且以小集落突变体为主；900、1 800、3 600 mg/kg剂量组平均微核率分别为0.85±0.58、1.10±0.97、1.45±1.12，与去离子水阴性对照组比较无显著性差异。
两色金鸡菊（Coreopsis tinctoria Nutt.）为菊科（Compositae）金鸡菊属（Coreopsis）一年生草本植物，原产于美洲，后分布于世界各地。两色金鸡菊自2000年引入我国，主要分布于新疆高海拔的昆仑山区，又称"昆仑雪菊"。已有研究发现，两色金鸡菊提取物富含黄酮类、香豆素、有机酸、氨基酸类、皂苷类、鞣质、多酚类等化学成分，具有较好的降脂、降压、调节血糖、抗菌及抗氧化等药理活
鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型（hi
共50只CD-1小鼠（雌雄各半），约5~6周龄，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（实验动物出售许可证号：SCXK（京）2016-0006），初次给药时体质量为23.8~37.6 g。小鼠饲养于屏障系统内PC聚碳酸酯鼠盒内，环境温度为20 ℃~26 ℃，湿度为40%~70%，每小时换气15次以上，照明时间每天12 h。试验期间给予
5810R型离心机（Eppendorf）；IOC42.XX1.C型气浴摇床；MIR-253低温恒温培养箱；SPECTRAmax-PLUS型酶标仪（Molecular Devices）；二氧化碳培养箱（HERA cell VIOS 160i，Thermo Fisher）；生物安全柜（NU-543-400S，Nuair）；倒置显微镜（CKX31，Nikon）等。
灭菌注射用水，石家庄四药有限公司生产；去离子水，本实验室去离子水机现用现制；呋喃基糠酰胺（Furylfuramide，AF-2），日本和光纯药工业株式会社生产；叠氮钠（NaN3），MERCK-Schuchardt生产；9-氨基吖啶（9-Aminoacridine，9-AA），ACROS ORGANICS生产；2-氨基蒽（2-Aminoanthracene，2-AA），Fluka生产；甲基甲烷磺酸酯（Methyl methanesulfonate，MMS）、环磷酰胺（Cyclophosphamide，CP）及突变选择剂三氟胸苷（Trifluorothymidine， TFT），均购自Sigma公司；营养肉汤（CM0067 Nutrient broth No.2）；英国OXOID生产；琼脂粉，购自日本；完全培养基由RPMI 1640培养基（Gibco）、0.2%NaHCO3（北京化学试剂公司）、1%青链霉素混合液（GIBCO）、丙酮酸钠（Amresco）配制而成，根据用途不同分为含10%马血清（传代、处理培养）、20%马血清（96孔板培养）和不含马血清（稀释）的培养液；TFT，终浓度3 μg/mL；S9，由多氯联苯诱导处理S.D雄性大鼠肝而获得，北京安宝迪科技有限公司生产；临用前配制S9含量为30%（细菌回复突变试验）或10%（MLA）的S9混合液（S9 mix）。
受试物两色金鸡菊，棕色花蕊、黄色花瓣的干品，购自新疆和田地区克里阳乡。前处理方法：称取两色金鸡菊100 g，蒸馏水100 ℃回流提取两次，每次提取1 h，第1次10倍量水，第2次8倍量水；将两次得到的提取液合并，经旋转蒸发浓缩至干燥，得到两色金鸡菊干燥提取物，粉碎，过80目筛即得两色金鸡菊棕褐色粉末（批号：20180713），提取率150 mg/g生药。体外试验使用以灭菌注射用水为溶媒配制为所需浓度的水溶液，0.5 g两色金鸡菊棕褐色提取物可溶于1 mL水。小鼠骨髓微核试验使用直接粉碎、过200目筛获得的两色金鸡菊粉末（批号：20180626），以去离子水为溶媒配制的混悬液。
特性鉴定合格的测试菌于-80 ℃保存，试验前在5 mL营养肉汤中接种20 μL（鼠伤寒沙门氏菌）或10 μL（大肠杆菌）细菌冻融液（含8%DMSO），水浴摇床37 ℃、120 r/min培养10 h；培养结束，在波长660 nm处测定新鲜菌液光密度，经计算确认活菌数浓度达1×1
采用标准平板掺入法。设立1.25、2.5、5、10 mg/皿4个剂量组、灭菌注射用水阴性对照组及阳性对照组（+S9：2-AA；-S9：AF-2，NaN3，9-AA；阳性剂配制时NaN3的溶媒为水，其余溶媒均为DMSO，添加终浓度见
注： a: AF-2, 0.1 μg/皿;
采用微孔法。设立1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL 5个浓度组、灭菌注射用水阴性对照组和阳性对照组（+S9：CP； -S9：MMS； 溶媒均为DMSO， 相应终浓度见表2-3）；每个浓度组平行2管，在+S9/3 h、-S9/3 h两种处理条件下检测。各组细胞处理液于37 ℃振荡培养箱中培养3 h，经处理和洗涤后的细胞于37 ℃、5% CO2孵箱中培养2 d进行表达，期间每日计测细胞密度，计算每天的细胞增值率（Daily cell growth， DCG， %）；处理当天制备检测表达0 d平板接种效率（Plating efficiency， PE，%）的PE0平板，表达结束制备检测表达2 d平板接种效率的PE2平板和基因突变频率（Mutation frequency， MF）的MF平板；PE0、PE2、MF平板分别于37 ℃、5% CO2孵箱培养11、9、14 d。培养结束，计数含与不含接种效率细胞克隆的孔数，并计算PE0和PE2、细胞相对存活率（Relative survival， RS）、相对悬浮生长率（Relative suspension growth， RSG）、相对总生长率（Relative total growth， RTG）；观察并分别计数含有突变细胞大集落（Large colony， LC）、小集落（Small colony， SC）及大、小集落（LC/SC）并存的孔数，计算总突变频率（T-MF）、大集落突变频率（L-MF）、小集落突变频率（S-MF）和小集落突变百分率（SCM）。
RSG（%）=（DCG1×DCG2）处理组/（DCG1×DCG2）阴性对照组×100%
DCG1=表达d1计测的细胞密度/表达d0调整后的细胞密度
DCG2=表达d2计测的细胞密度/表达d1调整后的细胞密度或计测的细胞密度
PE0（2）＝-ln（EW/TW）/1.6 ， EW： 空孔数； TW： 总孔数
RS0（2）（%）＝（PE处理组/PE阴性对照组）×100%
RTG（%）=RS2×RSG×100%
MF（×1
SCM（%）=（S-MF/T-MF）×100%
两色金鸡菊（粉末，200目）以去离子水为溶媒可配制为混悬液且不堵塞小鼠灌胃针的最高浓度为180 mg/mL。小鼠连续灌胃给药最高可给予体积为20 mL/kg。故以3 600 mg/kg为两色金鸡菊（粉末）最高给药剂量，下设1 800、900 mg/kg分别为中、低剂量，间隔24 h共给药3次。试验包括3个受试物剂量组，并平行设置去离子水阴性对照组和阳性对照组（CP，80 mg/kg）。阳性对照单次腹腔注射给药，其他各组均灌胃给予，给药体积均为20 mL/kg。试验期间观察动物临床症状及体质量变化。末次给药后约18~24 h取材，取材时摘取双侧股骨，并用胎牛血清冲洗骨髓制备骨髓细胞悬液，手工推片。样本自然晾干后分别经吉姆萨或吖啶橙染色。每只动物计数200个骨髓红细胞中嗜多染红细胞（Polychromatic erythrocytes，PCE）所占比例，并观察计数至少2 000个PCE以判断MNPCE（Micronucleated polychromatic erythrocytes， MNPCE）发生率。
细菌回复突变试验结果以每组回变菌落数的±s表示；-S9和/或+S9条件下，至少在1个菌株上，受试物组的回变菌落数≥阴性（溶媒）对照组的2或3倍以上，并同时具有剂量-反应关系或一个测试点呈现可重复性时，结果判为阳性。MLA、RSG、RS、RTG表示细胞毒性水平，MF、SCM表示突变水平；若受试物一个以上浓度组的MF显著高于阴性（溶媒）对照组，或是阴性（溶媒）对照组的3倍以上，并有剂量-反应趋势，则判为阳性结果；若仅在相对存活率低于20%的高剂量情况下出现阳性，则结果为“可疑”；若在相对存活率低于20%的高剂量情况下未见突变频率的增加，则结果判为阴性。小鼠骨髓微核试验，采用“Poisson分布两样本均数比较”方法比较给药组的微核率与阴性对照组之间的差异是否存在统计学意义上的显著性；当P<0.05时，认为存在显著性差异。
如
如
试验期间阴性对照组、阳性对照组及所有给药组动物未见动物死亡、濒死，均无异常临床症状，且各剂量组动物的平均体质量与同性别相同时间段对照组比较均未见显著性差异。如
注： **表示P<0.01
本文分别开展细菌回复突变试验、MLA和小鼠骨髓微核试验，评价两色金鸡菊的潜在遗传毒性风险。细菌回复突变试验和MLA采用不同的体外评价体系检测受试物的致突变性，前者所用4株沙门氏菌可检测组氨酸合成位点hi
两色金鸡菊主要成分之一生物总黄酮（即黄酮类化合物，本文水提取物中含量为460 mg/g提取物）广泛存在于植物界。有研究报
本文在对两色金鸡菊开展的三项遗传毒性试验中得到“二阴一阳”的结果，结果不一致可能来自评价体系不同以及体内外试验生物系统、代谢途径等差异，如：体外形成的代谢产物未必在体内形成；活性代谢产物可能在体内迅速被解毒而体外则不能；受试物及其代谢产物在体内可快速和高效排泄等。与体外试验相比，体内试验方法具有考虑到与人体应用相关的吸收、分布、排泄的优点，而且体内代谢相对于体外试验中的代谢系统更具有相关
综上，两色金鸡菊可能具有遗传毒性风险。后续可开展染色体畸变试验和体内Pig-a基因突变试验对其遗传毒性风险进行研究验证。本文结合三项针对不同检测终点的试验方法对两色金鸡菊的遗传毒性风险进行评价，并首次报道两色金鸡菊的MLA研究结果，为其遗传毒性风险评估提供参考。
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