食品沙门氏菌现行国内外标准中选择性增菌和分离的等效性评估

刘玥，刘夏，崔琳，陈敏，刘弘，顾其芳，胡屹，许学斌; LIU Yue; LIU Xia; CUI Lin; CHEN Min; LIU Hong; GU Qifang; HU Yi; XU Xuebin

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食品沙门氏菌现行国内外标准中选择性增菌和分离的等效性评估 PDF

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刘玥 ^1,2
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刘夏 ³
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陈敏 ¹
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刘弘 ¹
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顾其芳 ¹
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胡屹 ^2,5
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许学斌 ¹
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1. 上海市疾病预防控制中心，上海 200336； 2. 复旦大学公共卫生学院，上海 200032； 3. 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海 201708； 4. 上海市临床检验中心，上海 200126； 5. 复旦大学公共卫生安全教育部重点实验室，上海 200032

中图分类号： R155

最近更新：2022-07-07

DOI：10.13590/j.cjfh.2022.03.013

摘要

目的

评估5种现行国内与国际食品沙门氏菌标准中选择性增菌步骤的等效性。

方法

按照GB4789.28—2013的方法使用沙门氏菌参比菌株验证5种沙门氏菌选择性增菌液亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）、罗伯特增菌液（RV）、穆勒-考夫曼四硫酸盐新生霉素增菌液（MKTTn）、亚硒酸盐煌绿增菌液（SBG）和5种选择性琼脂平板沙门氏菌显色琼脂平板（CAS）、木糖-赖氨酸-脱氧胆酸盐琼脂平板（XLD）、木糖赖氨酸十四烷基硫酸钠琼脂平板（XLT4）、亚硫酸铋琼脂平板（BS）和赫氏肠道菌琼脂平板（HE）的生长率（P_R）和特征性生长；按照ISO 16140—2： 2016和传统统计学方法设计路径，经高污染样品检测比较5种选择性增菌液和2种选择性琼脂平板的组合方法的敏感性、相对真值和可接受限值，评估10种增菌分离组合的分离敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。

结果

SC对猪霍乱和猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种存在无效增殖；CAS和XLD识别伤寒和非伤寒、硫化氢差异表达沙门氏菌能力明显优于XLT4、HE、BS；84件样品（畜肉22件、禽肉32件和水产品30件）经5种增菌组合确认25件阳性（29.76%）、鉴定分型42株沙门氏菌。5种组合方法的敏感性分别为：84.00%、100.00%、88.00%、88.00%和92.00%，没有统计学差异（P>0.05）。按照ISO 16140—2： 2016释义组合1（SC+TTB）因SC存在漏检导致可接受限值超限；10种增菌组合中以RV-CAS综合效益最好，敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为：68.00%、95.00%、85.00%、88.00%。

结论

SC因窄谱增菌效果，影响方法敏感性、导致负偏差结果偏倚，使可接受限值超限值；增菌组合推优RV-CAS，平板组合推荐CAS+XLD；建议GB4789.4能完善沙门氏菌血清鉴定，加强应对流通样品混合菌型污染及接轨国际食品微生物标准。

关键词

沙门氏菌检验标准; 微生物的确认方法; 等效性; 可接受限值; 混合菌型污染食品

沙门氏菌是重要的人畜共患和食源性致病菌，其致病性按病症类型分为肠内感染型和肠外侵袭型，侵袭型病例致死率可达30%^［

1］。世界卫生组织（World Health Organization， WHO）估测每年全球感染性腹泻约5.5亿人，5岁以下儿童达2.2亿，沙门氏菌是其中最常见病因之一^{［参考文献 2

百度学术}2］。人类通过摄入污染沙门氏菌的食品（尤其是加工动物类食品）引发感染或持留。食品安全标准是国家监管食品和饲料产业供应的法理基础，伴随食品贸易全球化，国内外对食品沙门氏菌检验方法的验证、比对和等效性评估带动了我国食品标准的升级、与国际规则的对接^{［参考文献 3

百度学术}3］。食品原料复杂性影响食品检测结果，故不同行业和领域的方法需进行等效性评估，强化技术互认^{［参考文献 4

百度学术}4］。国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）针对食物链微生物的最新确认方法（ISO16140—2：2016）^{［参考文献 5

百度学术}5］调整了食品微生物检测方法等效性评估的核心统计学参数。本研究遵循食品微生物检验国家标准培养基和试剂质量要求（GB4789.28—2013）^{［参考文献 6

百度学术}6］与ISO16140—2：2016规则^{［参考文献 5

百度学术}5］，集成现行国内外食品沙门氏菌检验标准方法中选择性增菌与分离组合，计算标准参数（方法敏感性、相对真值、可接受限值、组合分离敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值），据此评估不同标准的等效性，为国家沙门氏菌检验标准（GB4789.4-2016）修订与优化提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 参比菌株

目标菌：伤寒沙门氏菌（CMCC50071）、甲型副伤寒沙门氏菌（硫化氢阴性，CMCC50093）、猪霍乱沙门氏菌（硫化氢阴性，ATCC7001）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028）、猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种（ATCC12011）；非目标菌：大肠埃希氏菌（ATCC25922）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）。鼠伤寒沙门氏菌为人源和食源优势菌型，具典型生化特征；猪霍乱沙门氏菌属于硫化氢阴性的侵袭性菌型；猪霍乱孔成道夫为相对苛氧的、产硫化氢的小菌落；伤寒和副伤寒为侵袭性菌型，其中甲型副伤寒为硫化氢阴性。综上，本研究选择5株参比菌株，涵盖优势与罕见、人源和食源、侵袭性和非侵袭性、伤寒和非伤寒、硫化氢阳性和阴性。

1.1.2 主要仪器与试剂

菌液浊度仪和细菌鉴定质谱仪VITEK MS（法国生物梅里埃公司）。

沙‍门‍氏‍菌‍显‍色‍琼‍脂‍平‍板‍（CHORMa‍gar ‍Salmo‍nella，CAS，批号2783228）、木糖-赖氨酸-脱氧胆酸盐琼脂平板（Xylose Lysine Deoxycholate，XLD，批号9227456）、木‍糖‍赖‍氨‍酸‍十‍四‍烷‍基‍硫‍酸‍钠‍琼‍脂‍平‍板‍‍（‍Xy‍lose ‍‍Ly‍sine Tergitol ‍4 ‍agar，‍XLT4，‍批‍号‍3282217）‍、亚硫酸铋琼脂平板（Bismuth sulphite agar，BS，批号2618354）和赫氏肠道菌琼脂平板（Hektoen Enteric agar，HE，批号1892334），以上材料均购自Becton，Dickinson and Company（BD）公司，按说明书配制、按GB4789.28—2013验收后置2 ℃~8 ℃避光保存，2周内使用。

哥伦比亚血琼脂平板、胰酪大豆胨蛋白胨琼脂平板（Tryptone soy agar，TSA）（广州迪景微生物技术有限公司）；哥伦比亚琼脂斜面、营养肉汤、沙门氏菌诱导软琼脂、肠道菌筛选双糖管及配套试纸、生理盐水（上海卓冀生物技术有限公司）；生化鉴定条API20E和氧化酶试剂等配套试剂（法国生物梅里埃）；沙门氏菌分型血清130种（丹麦SSI诊断公司）。所有商业即用型平板和试剂、诊断血清等避光置2 ℃~8 ℃保存，均按说明书使用。

缓冲蛋白冻水（Buffered Peptone Water，BPW批号2732118）、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（Selenite cystine broth，SC，批号7363732）、四硫磺酸钠煌绿增菌液（Tetrathionate broth，TTB，批号8281593）、罗伯特增菌液（Rappaport Vassiliadis broth，RV，批号9266117）、穆勒-考夫曼四硫酸盐新生霉素增菌液（Muller Kauffmann tetrathionate novobiocin，MKTTn，批号1026705）、亚硒酸盐煌绿增菌液（Selenite brilliant ‍green ‍enrichment ‍broth，‍SBG，‍批‍号‍8230128），以上试剂均购自Becton， Dickinson and Company（BD）公司，按说明书配制、按GB4789.28-2013验收后置2 ℃~8 ℃避光保存，2周内使用。

1.2 方法

1.2.1 沙门氏菌选择性增菌液的验证

生长率半定量测试：依据GB4789.28—2013，制备目标菌和非目标菌的新鲜肉汤培养物和10倍梯度菌悬液，分别吸取不同稀释度菌悬液1 mL接种TTB、SC、RV、MKTTn、SBG混匀，SC、MKTTn、SBG置于36 ℃、RV置于42 ℃、TTB置于43 ℃，培养18 h后分别划线接种XLD，36 ℃培养24 h后进行菌落计数。每一稀释度涂布平板2个。评价标准：目标菌在XLD的菌落应>10 CFU；符合沙门氏菌在XLD的典型菌落特征。

1.2.2 沙门氏菌选择性琼脂平板的验证

生长率定量测试：分别取1.2.1中目标菌的梯度菌悬液100 μL涂布于TSA和XLD，每一稀释度涂布平板2个，36 ℃培养24 h进行菌落计数，计算生长率（P_R）并确认预期的典型菌落生长。典型菌落特征：BS：中等偏小、产硫化氢、有金属光泽暗绿色菌落；HE：中等偏小、产硫化氢、蓝绿色菌落；XLD和XLT4：中等大小、产硫化氢菌落、边缘半透明淡红色或原色菌落；CAS：中等大小、边缘光滑湿润酒红色菌落。

1.2.3 多方法的选择性增菌与分离组合等效性评估

2019年7月至9月，选择上海地区的定点超市，采集市售流通肉制品和水产品84件（每月28件）：畜肉22件、禽肉32件和水产品30件。样品单独包装、每份样品称取25 g，均质混匀225 mL BPW，36 ℃培养8 h，取1 mL BPW加入TTB、SC、SBG、MKTTn、另吸取0.1 mL BPW加入RV中。SC、SBG、MKTTn置于36 ℃、RV置于42 ℃、TTB置于43 ℃培养18 h，从5种选择性增菌液各取10 μL接种XLD和CAS，36 ℃培养24 h，观察菌落特征。挑取选择性平板挑取2个及以上的疑似典型菌落，完成肠道菌筛选双糖管初筛试验，初筛符合者进行系统生化和质谱鉴定，符合沙门氏菌属者鉴定血清型，分析统计参数（图1）。

图1 基于沙门氏菌高污染样本的统计学参数评估不同组合方法等效性的技术路线

Figure 1 The technical route for evaluating the equivalence of different methods with statistical parameters on highly contaminated foods

^a：组合1参考食品安全国家标准沙门氏菌检验^[

7] ，组合2参考美国FDA细菌检测手册第八版^{[参考文献 8

百度学术}8]，组合3参考ISO食品和动物饲料微生物学沙门氏菌检测^{[参考文献 9

百度学术}9]，组合4参考日本厚生劳动省食品卫生检查指针微生物篇^{[参考文献 10

百度学术}10]，组合5参考上海市沙门氏菌病监测方案^{[参考文献 11

百度学术}11]；^b：SE表示方法敏感性；RT表示相对真值；AL表示可接受限值；Se表示分离敏感性；Sp表示特异性；PPV表示阳性预测值；NPV表示阴性预测值；参数计算公式详见1.2.4

1.2.4 释义相关统计学参数

参考ISO16140—2：2016和传统统计学方法^［

12］，计算实样检测结果的统计学参数：共阳结果（Positive agreement，PA）为基于各组合方法确认的结果与单个组合方法确认的结果经确认一致为阳性；共阴结果（Negative agreement，NA）为基于各组合方法确认的结果与单个组合方法结果一致为阴性；正偏差结果（Positive deviation，PD）为基于各组合方法确认的结果为阴性，单个组合方法结果经确认为阳性；负偏差结果（Negative deviation，ND）为基于各组合方法确认结果为阳性，单个组合方法结果为阴性；可接受限值（Acceptability limit，AL）为基于各组合方法确认的结果与单个组合方法结果之间的最大正负偏差的和与（或）差；相对真值（Relative trueness，RT）为相同样品使用不同方法得到的结果与基于各组合方法确认的结果的对应程度，RT=（PA+NA）/样品数×100%；使用相同预增菌液（BPW）的做法可视为配对研究（Paired study）；方法敏感性（Sensitivity，SE）反映方法检出沙门氏菌的客观能力，SE=（PA+PD）/（PA+ND+PD）×100%；真阳性（True positive，TP）为典型菌落经鉴定为沙门氏菌的样品（数）；假阳性（False positive，FP）为典型菌落经鉴定为非沙门氏菌的样品（数）；真阴性（True negative，TN）为非典型菌落经鉴定为非沙门氏菌的样品（数）；假阴性（False negative，FN）为非典型菌落经鉴定为沙门氏菌的样品（数）；分别统计各选择性增菌液和分离平板组合的分离敏感性（Sensitivity，Se）（Se=TP/（TP+FN））、特异性（Specificity，Sp）（Sp=TN/（TN+FP）‍）‍、‍阳‍性‍预‍测‍值‍（Positive predictive ‍value，‍PPV）（PPV=TP/（TP+FP）‍）‍和‍阴‍性‍预‍测‍值‍（Negative predictive value，NPV）（NPV=TN/（TN+FN））。

1.3 统计学分析

应用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计学分析，运用Pearson χ²检验对SE、RT进行多组间比较，当P<0.05时被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 验证沙门氏菌选择性增菌液

目标菌和非目标菌悬液浓度（CFU/mL）计算结果表明，鼠伤寒沙门氏菌为2.0×10⁸ CFU/mL；猪霍乱沙门氏菌为1.7×10⁸ CFU/mL；猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种为1.8×10⁸ CFU/mL；伤寒沙门氏菌为1.6×10⁸ CFU/mL；甲型副伤寒沙门氏菌为1.7×10⁸ CFU/mL；大肠埃希氏菌为2.3×10⁸ CFU/mL；铜绿假单胞菌为2.1×10⁸ CFU/mL。

半定量生长率测试结果表明，根据平板计数结果确认目标菌的10^-7稀释度（10~100 CFU）和非目标菌的10^-5稀释度（1 000~5 000 CFU）为预期接种量。计算对应稀释菌液在XLD的回收菌落数并取平均值：除猪霍乱及猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种在SC（XLD）计数<10 CFU，其他选择性增菌液选择性良好（表1）。提示SC在非目标菌干扰环境下对猪霍乱及猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种的增菌倍数小于1，增殖或促生长作用有限。

表1 目标菌测试5种选择性增菌液半定量生长率

Table 1 The test of growth rates of Salmonella reference strain for 5 selective enrichment broths through the use of semi-quantitative method

目标菌（XLD/CFU）	RV	TTB	SC	MKTTn	SBG
鼠伤寒沙门氏菌	+	+	+	+	+
猪霍乱沙门氏菌	+	+	-	+	+
猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种	+	+	-	+	+
伤寒沙门氏菌	+	+	+	+	+
甲型副伤寒沙门氏菌	+	+	+	+	+

注： +：>10 CFU；-：≤10 CFU

2.2 验证沙门氏菌选择性琼脂平板

2.2.1 目标菌在5种选择性琼脂平板的特征性反应

CAS验证5株目标菌符合预期典型菌落（5/5）；因猪霍乱沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌为硫化氢阴性株，故XLD未观察到预期典型菌落（3/5）；BS较XLD未观察到猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种的预期典型菌落（2/5）；HE和XLT4较BS未观察到伤寒沙门氏菌的预期典型菌落（1/5）。以上结果见表2。本次验证5种选择性琼脂平板预期典型菌落的生长效果依次为CAS、XLD、BS、HE、XLT4。

表2 目标菌验证5种选择性琼脂平板特征性反应

Table 2 The colony characteristics of Salmonella reference strains for 5 selective mediums

目标菌	CAS	XLD	BS	HE	XLT4
鼠伤寒沙门氏菌	+	+	+	+	+
猪霍乱沙门氏菌	+	-	-	-	-
猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种	+	+	-	-	-
伤寒沙门氏菌	+	+	+	-	-
甲型副伤寒沙门氏菌	+	-	-	-	-
统计典型菌落敏感性	5/5	3/5	2/5	1/5	1/5

注： +为典型生长；-为不典型生长

2.2.2 沙门氏菌选择性琼脂平板的生长率定量测试

选择合适稀释度计算TSA和XLD菌落数，计算5株沙门氏菌在不同选择性琼脂平板的生长率P_R（表3）。按照GB4789.28—2013，5种选择性琼脂平板对指定质控菌株（鼠伤寒和/或伤寒沙门氏菌）的P_R均>0.5，均符合质控评定标准（图2）；5株目标菌在5种选择性琼脂平板上的P_R结果判断：BS除鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌外，其他目标菌的P_R均未达0.5；猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种在HE的P_R未达0.5；XLD、XLT4和CAS的5株目标菌P_R均超0.5。综合特征性反应和生长率测试（表2和表3），选择CAS和XLD作为本次组合方法等效性评估的选择性琼脂平板。

表3 目标菌测试5种选择性琼脂平板的生长率

Table 3 The test of growth rates of Salmonella reference strains for 5 selective mediums

目标菌	BS		HE		XLD		XLT4		CAS
目标菌	N_s	P_R	N_s	P_R	N_s	P_R	N_s	P_R	N_s	P_R
鼠伤寒沙门氏菌	101	0.51	107	0.54	122	0.62	136	0.69	142	0.72
猪霍乱沙门氏菌	77	0.46	90	0.54	98	0.58	105	0.63	132	0.79
猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种	54	0.30	85	0.47	102	0.56	118	0.65	123	0.68
伤寒沙门氏菌	89	0.55	82	0.51	117	0.73	120	0.75	124	0.77
甲型副伤寒沙门氏菌	56	0.33	88	0.52	97	0.57	115	0.68	129	0.76

注：生长率P_R =N_s/N₀，N_s为琼脂平板上获得的菌落数（CFU），N₀为TSA上获得的菌落数（CFU）；鼠伤寒沙门氏菌N₀=198，猪霍乱沙门氏菌N₀=168，猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种N₀=181，伤寒沙门氏菌N₀=161，甲型副伤寒沙门氏菌N₀=170

图2 目标菌测试5种选择性琼脂平板的生长率

Figure 2 The test of growth rates of Salmonella reference strains for 5 selective mediums

2.3 高污染实样检测结果

84件样品包括畜肉22件、禽肉32件和水产品30件。经系列增菌、分离和鉴定流程，共确认阳性样品25件（总敏感性100%），分离率为29.76%（25/84），共分离沙门氏菌42株，均经系统生化、质谱和血清学鉴定。阳性样品中11件（11/25，44.00%）混合2种以上血清型。42株沙门氏菌型：鼠伤寒（7株）、罗森（5株）、伦敦（5株）、肠炎（4株）、德比（4株）、鸭（4株）、黄金海岸（3株）、科瓦利斯（2株）、明斯特（1株）、火鸡（1株）、哈达尔（1株）、科特布斯（1株）、肯塔基（1株）、汤卜逊（1株）、利文斯通（1株）和胥戈成格隆（1株）。

2.4 基于ISO 16140—2: 2016敏感性研究评价组合方法

本次84件样品均为沙门氏菌高污染样品（生鲜食品），每一种样品数均大于20件，按ISO 16140：2—2016得到不同组合方法分离的敏感性结果。根据结果，组合2的SE和RT最高（100.00%，100.00%），其次为组合5（92.00%，96.70%）、组合3‍和‍4（88.00%，96.40%）‍、‍组‍合‍1（84.00%，95.20%）。经统计分析，5种组合的SE和RT差异均无统计学意义（P>0.05）。可接受限值（AL）为ISO 16140：2—2016新增评价指标，反应不同方法检测相同样品时，方法之间最大的可接受差异（该差异取决于研究类型和测试样品类型），同一类样品的配对研究中AL（ND-PD）和AL（ND+PD）应分别≤3和6。本次组合1的AL（ND-PD）超出ISO标准释义的可接受限值，其他方法的AL均在可接受范围内。导致组合1超限的原因为ND较高，即组合1存在更多漏检，造成SE和RT偏低及AL（ND-PD）超限（表4）。

表4 基于ISO 16140—2: 2016敏感性研究评价5种组合方法敏感性和可接受限值

Table 4 The evaluation of the sensitivity and the acceptable limits for 5 protocols based on the ISO 16140—2:201

组合^a	PA	NA	ND	SE/%	RT/%	AL（ND-PD）	AL（ND+PD）
1	21	59	4	84.00^{[参考文献 13 百度学术}13]	95.20	4（超限^b）	4
2	25	59	0	100.00^{[参考文献 13 百度学术}13]	100.00	0	0
3	22	59	3	88.00	96.40	3	3
4	22	59	3	88.00^{[参考文献 13 百度学术}13]	96.40	3	3
5	23	59	2	92.00^{[参考文献 13 百度学术}13]	96.70	2	3

注：总敏感性=25（100%）；^a：组合1：TTB+SC，组合2：TTB+RV，组合3：RV+MKTTn，组合4：TTB+SBG，组合5：RV+SBG；^b：根据ISO 16140:2-2016释义一类样品的AL（ND-PD）和AL（ND+PD）应分别≤3和6

2.5 基于传统方法学统计参数评价组合方法

按传统统计学参数经数据分层和计算，TP最高的组合是RV-CAS和TTB-CAS（17/25）、最低的组合是SC-XLD和SC-CAS（0/25）；FP值最高组合是SC-CAS（8）；TN数值接近；FN值最低组合是RV-CAS和TTB-CAS（8/59）。Se最高为RV-CAS（68.00%）和TTB-CAS（68.00%），其次为TTB-XLD（60.00%）。Sp值差异小，无法反映组合方法之间的客观差异。PPV和NPV为效益评价指标，最高为RV-CAS（85.00%和88.00%）。具体信息见表5。

表5 基于传统方法学统计参数评价单一增菌与分离组合的能效

Table 5 The evaluation for efficacy of the compound modes based on the classical statistical methods

增菌-分离组合	TP	FP	TN	FN	百分率/%
增菌-分离组合	TP	FP	TN	FN	Se	Sp	PPV	NPV
RV-XLD	12	4	55	13	48.00^{[参考文献 13 百度学术}13]	93.00	75.00	81.00
RV-CAS	17	3	56	8	68.00^{[参考文献 13 百度学术}13]	95.00	85.00	88.00
TTB-XLD	15	6	53	10	60.00^{[参考文献 13 百度学术}13]	90.00	71.00	84.00
TTB-CAS	17	4	55	8	68.00^{[参考文献 13 百度学术}13]	93.00	81.00	87.00
SC-XLD	0	3	56	25	0.00^{[参考文献 13 百度学术}13]	95.00	0.00	69.00
SC-CAS	0	8	51	25	0.00^{[参考文献 13 百度学术}13]	86.00	0.00	67.00
MKTTn-XLD	13	3	56	12	52.00	95.00	81.00	82.00
MKTTn-CAS	12	4	55	13	48.00	93.00	75.00	81.00
SBG-XLD	14	7	52	11	56.00^{[参考文献 13 百度学术}13]	88.00	67.00	83.00
SBG-CAS	12	3	56	13	48.00^{[参考文献 13 百度学术}13]	95.00	80.00	81.00

3 讨论

沙门氏菌定植于养殖动物和自然环境，在肉制品的加工生产过程中容易污染，监管部门依靠食品终端微生物检验加强产业链的安全监管。本次研究遵循培养基质控国标和国际主流确认方法，在传统微生物方法重视选择性增菌液的敏感性和分离平板表现的预期典型菌落特征的基础上，验证影响食品中沙门氏菌检测流程中选择性增菌和分离组合的统计学评价参数，客观评价不同材料和方法组合检测高污染样品增菌与分离的结果差异化。

常规分离培养作为易普及、易操作的传统基础方法仍在微生物检测领域、尤其是食品沙门氏菌常规分离流程中发挥重要作用，增菌液是影响食品沙门氏菌检验体系敏感性的关键技术控制点^［

13-14］。本次选择性增菌液验证SC对伤寒、副伤寒适度有效增菌，但其对低载量（10~100 CFU）猪霍乱沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种存在无效增菌或抑制作用。猪霍乱不产生硫化氢，是猪源定殖生态型沙门氏菌，对猪致病力弱，对人有具侵袭性，国内缺少其生态污染和临床监测数据存在关联的报道^{［参考文献 1

百度学术}1，13］。此外，SC依赖经验配制、效期短、批间质控差异大^{［参考文献 15

百度学术}15］，目前国外标准中除少数特殊食品原料外，SC皆被其他增菌液替代^{［参考文献 8-9}8-9］。

沙门氏菌现有2个种、6个亚种和2 659个血清型^［

16］。本次选取肠道沙门氏菌亚种I的5株目标菌进行材料验证，兼顾伤寒副伤寒和非伤寒副伤寒、硫化氢阳性和阴性的沙门氏菌型、侵袭型和非侵袭型等代表性，5种常用选择性分离琼脂平板的生长率和菌落特征：CAS对5种目标菌的定量验收符合质量评价标准，排除菌株不产硫化氢的特性后，XLD符合质量评价标准。而BS、HE和XLT4均存在生长率不达标或菌落特征不典型的现象。GB4789.28—2013可以满足沙门氏菌培养基质量验收，但使用者需认知沙门氏菌不同亚种存在表型差异（硫化氢、乳糖）。

2002年起，我国陆续报道硫化氢阴性沙门氏菌的食源性暴发^［

17-21］。针对国内外多种标准方法等效性研判，我们认为皆有漏检硫化氢阴性沙门氏菌的可能性，所以本次研究使用的CAS+“N”双平板组合模式可满足硫化氢阴性沙门氏菌检测需求^{［参考文献 22-23}22-23］，推荐将“CAS+XLD”优先作为食品类基质样品的沙门氏菌选择性分离组合。

食品受加工工艺与方式、内在物理与化学因素影响，较临床微生物沙门氏菌的检验，更具挑战与应用视角^［

13］。为避免材料和方法对结果影响，本次研究限定预增菌和鉴定流程，将选择性增菌作为变量，以期得到客观结论。入选增菌分离组合方法参考国内外标准和上海食源感染性监测方案^{［参考文献 7-11}7-11］。在总计25件阳性样品中有11件分离2种以上菌型，提示沙门氏菌是食品产业链中的重要污染源，给“农场到餐桌”的食品安全溯源体系带来挑战，而GB4789.4—2016对血清分型未做强制要求，无法揭示流通食品存在的混合菌型污染和溯源食源性暴发^{［参考文献 16

百度学术}16］。ISO16140：2—2016将可接受限值（AL）作为新指标纳入，其设定并非基于数据统计分析，而是基于大数据和专家共识^{［参考文献 5

百度学术}5］。5种增菌分离组合的SE和RT差异均无统计学意义，但组合1的AL（ND-PD）超出推荐限值，组合1超限原因为SC无效检验导致偏差影响ND数值升高，其他增菌分离组合的差异在可接受范围之内。本次实样证实，RV预期综合效益最佳：RV-CAS的Se、Sp、PPV和NPV分别为68.00%、95.00%、85.00%和88.00%，RV自20世纪后期至2000年后逐渐被国际接纳^{［参考文献 24-26}24-26］。现行ISO 16140：2-2016将特异性评价指标（Sp）删除，以SC为例，由于其Sp值差异小，的确无法反映组合方法间的差异，故我们认为NPV较Sp更能体现方法本身导致的无效检测，亦更直观反映检测方法固有缺陷导致人财物损失。

本次扩展具有表型代表性的目标菌，对5种选择性增菌液和5种选择性琼脂平板进行验收和评估。数据证明GB4789.28—2013仅适用于沙门氏菌各类增菌液和平板的质量验收，如需要系统客观评价关键性分离材料，应引入更为科学的统计学评价指标和方法学性能、效益参数（回收率、等效性、均一性）。本次所用材料控制遵循统一验收与验证标准，但无法排除关键分离材料因不同批次出现的结果偏倚。

食品作为重要的全球消费品，世界各国均加强对标准方法等效性评估，以满足贸易与消费需求^［

4］。食品标准更需要服务国内市场和食品安全监管，更主要为优质合格的高附加值产品走出国门保驾护航。

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