2015年11月16日美国食品药品管理局（FDA）发布公告确定水优鲑鱼（商品名AquAdvantage salmon，AAS）与非转基因鲑鱼一样安全，这标志着转基因鲑鱼获得美国权威机构的最终批准，依法可以商业销售及食用^［1-3］。　　转基因鲑鱼AAS由加拿大水丰（AquaBounty）公司研发，自1995年水丰公司致函美国FDA申请调查开始，到获得批准所花时间约二十年^［2］。　　AAS经由将构建的美洲绵鳚抗冻蛋白基因5’端启动子调控序列-大鳞大马哈鱼（王鲑）的生长激素蛋白编码区（opAFP-GHc2）显微注射到野生鲑鱼鱼卵研发而成，所使用的转基因片段来自大鳞大马哈鱼（王鲑）的生长激素蛋白编码区和美洲绵鳚抗冻蛋白基因启动子调控序列。转入重组生长激素基因的鲑鱼可在寒冷环境下仍然保持生长，使转基因鲑鱼达到上市规格的生长周期由3年缩短至18个月，大大降低了鲑鱼的养殖成本^［4-6］。　　转基因鲑鱼直接食用的安全性是人们关注的焦点，另外其生态安全性也值得重视：转基因鲑鱼可能与自然环境中的其他鱼种发生有性交配，导致转基因漂移到自然鱼中，影响物种遗传多样性，或产生其他的未知风险。目前对转基因产品多数国家均采用相应的标识管理制度^［7-8］，标识管理制度的建立和实施依赖于有效、准确的检测鉴定技术。品系特异性（转化事件特异性）聚合酶链式反应（event-specific PCR）检测的目标序列是外源插入序列与目的基因组间连接区，相较于筛选PCR（screening PCR）、基因特异性PCR（gene-specific PCR）和构建特异性PCR（construct-specific PCR）具有更高的特异性，能用于鉴定转基因具体品系（甚至是同一质粒转化的不同品系），是目前转基因产品品系检测鉴定最重要的方法^［9］。本试验针对AAS插入的美洲绵鳚抗冻蛋白基因启动子区域与鲑鱼基因组DNA的5’端连接区序列，建立特异性强、灵敏度高和稳定性良好的实时荧光定量PCR检测方法，满足监管部门对其转基因鲑鱼AAS正确标识的需求。
　　大西洋鲑鱼、赤鮸鱼、带鱼、金线鱼、龙虾、鲈鱼、乌鲳鱼、鲳鱼、帝王蟹、青口贝和白虾由本实验室收集储备。
　　ABI 7500和ABI 7500FAST实时荧光定量PCR仪（美国应用生物系统）、nanodrop2000c微量分光光度计（美国Thermo）、研磨机。　　Wizard基因组DNA纯化试剂盒［普洛麦格(北京)生物技术有限公司］；Primex Ex Taq(2×) for qPCR（大连宝生物工程有限公司）；质粒DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；引物和探针由上海闪晶分子生物科技有限公司合成，稀释成浓度为10 μmol/L的工作液使用。
称取研磨后的100 mg鱼肉样品，使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒提取DNA，每次DNA提取均设置提取空白对照，微量分光光度计测定浓度。
转基因鲑鱼内源生长激素(growth hormone，GH)和AAS品系特异性双基因阳性质粒［将GH基因的160 bp片段(如图1)和AAS的5’品系特异性边界序列的150 bp片段(如图2)构建到AmpR抗性的PUC57载体上，构建得到的质粒转入受体菌DH5a后-70 ℃保存。以下称AFP-Aqu质粒］为本实验室构建。
根据转入的美洲绵鳚抗冻蛋白基因启动子区域与鲑鱼基因组5’端边界序列（位置如图3中A处所示），应用Primer 5.0软件设计引物和探针（扩增的序列片段见图2）。将设计的引物、探针经美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站上使用BLAST数据库比对确定引物和探针的理论特异性；鲑鱼内源基因采用于鱼类生长激素（扩增的序列片段见图1），用于鲑鱼来源样品DNA的检测及转基因成分的相对定量。具体引物探针信息见表1。
PCR反应体系为20 μl，其中Premix Ex TaqTM 10 μl，ROX Reference Dye II 0.2 μl，DNA 模板2 μl，10 μmol/L 的Aqu-F、Aqu-R和探针Aqu-P按A、B和C三组配比添加，ddH₂O补足体积。反应程序为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s、58或60 ℃退火延伸34 s，40个循环，于58或60 ℃退火延伸时收集荧光信号。A组Aqu-F、Aqu-R和探针Aqu-P体积分别配比分别为0.5、0.5、1 μl，B组为0.4、0.4、0.8 μl，C组为0.2、0.2、0.4 μl，即A组上游引物、下游引物和探针的终浓度分别为250、250和500 nmol/L，B组为200、200和400 nmol/L，C组为100、100和200 nmol/L。适宜的引物和探针浓度组合根据循环阈值（Ct值）、荧光强度和扩增曲线综合判定。
采用大西洋鲑鱼、赤鮸鱼、带鱼、金线鱼、龙虾、鲈鱼、乌鲳鱼、鲳鱼、帝王蟹、青口贝和白虾的DNA为模板，阳性样品为转基因鲑鱼AFP-Aqu质粒，阴性对照为大豆DNA。对建立的实时荧光PCR检测方法进行特异性测试。
将分别将提取的AFP-Aqu质粒DNA溶液稀释至300 000、30 000、15 000、3 000、1 500、300、150、30、15拷贝/μl，加入2 μl作为模板，进行实时荧光PCR检测，每份样品3个平行，根据其Ct值的计算标准偏差(SD)和相对标准偏差(RSD)，并选择线性范围建立标准曲线。
将转基因鲑鱼AFP-Aqu质粒DNA用ddH₂O稀释至300、150和30拷贝/μl分别进行扩增，测定本方法的定量下限（limit of quantification，LOQ），每个浓度20个重复。统计Ct值分析得出LOQ。
退火温度分别为60和58 ℃时，A、B、C组的引物和探针终浓度配比结果如图4、5所示，A、B、C组引物与探针均得到良好的扩增曲线，结合扩增曲线、Ct值及经济性，拟选择B组作为体系反应的浓度。B组引物探针在58和60 ℃检测的Ct值相差不明显，结合检测方法的通用性，选择退火温度为60 ℃。 最后确定的20 μl反应体系如下：Premix Ex TaqTM 10 μl，ROX Reference Dye II 0.2 μl，10 μmol/L Aqu-F和Aqu-R各0.4 μl，探针Aqu-P 0.8 μl，DNA 模板2 μl和ddH₂O 6.2 μl；反应程序为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s、60 ℃退火延伸34 s，40个循环，于60 ℃收集荧光信号。
以大西洋鲑鱼等12种非转基因鲑鱼样品的DNA和转基因鲑鱼阳性质粒AFP-Aqu质粒的DNA为模板，采用AAS的品系特异引物和探针Aqu-F/R/P进行实时荧光PCR扩增，如图6所示，只有转基因鲑鱼AFP-Aqu质粒的DNA成功扩增，其他DNA样品均无典型的实时荧光扩增曲线。上述结果表明AAS的品系特异性引物和探针的特异性良好。
将提取AFP-Aqu质粒DNA稀释至300 000、30 000、15 000、3 000、1 500、300、150、30、15 拷贝/μl，加入2 μl DNA作为模板，进行AAS实时荧光PCR检测，每份样品进行3次重复试验，水为空白对照，计算Ct值的SD和RSD，如表2所示，扩增曲线如图7所示。由表2可知，在模板量为600 000～60拷贝范围内所得的Ct值表明，其SD介于0.03～0.35，RSD介于0.12%～1.01%均在可接受范围内^［11］，即600 000～60拷贝范围内可重复性良好。采用600 000～60拷贝8个浓度梯度所得Ct值建立标准曲线，其线性回归方程为：y=-3.2194x+40.805，R²=0.997＞0.98，扩增效率为104%（介于90%～110%），表明其线性相关性良好，扩增效率良好，均符合欧洲转基因实验室联盟（ENGL）相关要求^［11］。
在2.3线性范围内采用转基因鲑鱼AFP-Aqu质粒DNA的30、150、300拷贝/μl三个梯度分别进行扩增，模板量2 μl，每个浓度20个重复，检测结果如表3和图8所示。以60拷贝扩增20次均出现阳性扩增，Ct值间的RSD＜0.25%，随着DNA浓度降低，SD逐渐变大，为得到稳定的扩增和定量结果，因此确定本方法的LOQ为60拷贝质粒DNA。
转基因三文鱼AAS是世界上第一个获批可直接食用的动物来源的转基因食品^［12］。在水丰技术公司转基因鲑鱼AAS等待美国FDA审批的十几年中，已有20家30种转基因鱼和转基因动物正在研究开发之中，其中有几种已经向FDA申请商业化^［1］。转基因鲑鱼AAS的上市，将为后面一大批送审的其他转基因食用动物提供了示范效应，对人们的生活将产生深远影响^［13-15］。目前各国对于转基因植物产品认定的阈值各不相同^［6,16］，转基因动物产品的尚未制定相关阈值。为保障消费者的知情权和选择权并为检疫监管部门提供转基因鲑鱼AAS产品标识的技术支持，建立准确、高通量、快速的转基因鲑鱼AAS检测技术至关重要。本试验针对美洲绵鳚抗冻蛋白基因启动子区域与鲑鱼基因组5’端邻接区序列建立的转基因鲑鱼AAS品系特异性实时荧光PCR方法，可实现对AAS品系高度特异、灵敏的检测与鉴定，满足口岸检验检疫部门的实际需求。