欧盟食品安全委员会^［1］、国际食品法典委员会（Codex标准）^［2］和我国GB 2763—2016《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》^［3］，严格规定了农牧产品中农药最大残留限量（maximum residue limits，MRLs），但是药用植物农药残留限量相关标准缺失严重。由于农药的广泛使用和长期使用，药用植物等原料中的农药残留不可避免。《中华人民共和国药典》2015版^［4］中明确提出，农药残留是影响中药材安全性的主要风险因素之一。2015版药典对黄芪、西洋参、人参等6个中药品种制定了有机氯农药（organochloride pesticides，OCPs）残留限量标准，并增订了药材、饮片及制剂中部分农药多残留质谱测定法，包括气相色谱-串联质谱法同时测定74种农药残留，其中含11种有机磷农药，目前药典中尚无植物类中药有机磷农药残留规定或限量。中草药保健食品原材料主要以药食同源的中药材、植物提取物为主，一些加工过程，如浓缩、干燥、精油提炼等，可能会导致农药残留水平升高，还可能导致某些农药成分发生变化，产生毒性更高的代谢产物^［5］，因此，为了避免中草药保健食品中农药超标、农药联合毒性对人体造成伤害，加强中草药保健食品农药残留监管及风险评估的力度，建立一套快速、简便、灵敏的检测方法十分必要。　　目前，农药残留的前处理方法主要有液液萃取法^［6］、QuEChERS法^［7］、固相萃取法^［8］、基质固相分散法^［9］等，其中分散液液微萃取（DLLME）法是近年来发展迅速的样品前处理技术，具有操作简便、富集倍数高、快速，尤其是有机溶剂用量少等优点，已经逐步在农药残留领域应用^［10-12］。在DLLME法萃取程序中，微量萃取剂在分散剂作用下与水溶液形成三相乳浊液体系，离心后萃取剂集中到最下层。在三相分配平衡过程中，萃取剂形成了细小的分散液滴，增大了与分析物的接触面积，能够快速有效达到分配平衡，完成萃取。本试验以中草药保健食品常见的3种剂型（片剂、硬胶囊剂和液体制剂）作为研究基质，采用分散固相萃取（d-SPE）和DLLME法联用的前处理技术，结合气相色谱-质谱（GC-MS）法同时测定了中草药类保健食品中29种农药残留。
　15份中草药保健食品均购自北京市药店，其中液体制剂（口服液）5份，固体制剂（含片剂、硬胶囊剂）10份。
　Thermo 1300-TSQ8000 Evo 气相色谱-质谱联用仪（美国Thermo）、离心机、涡旋振荡器、氮吹仪、电热恒温水浴锅、干式恒温混匀仪、Milli-Q Reference型超纯水机、商品化12 ml PSA/C18净化管［美国色谱科，填料为150 mg N-丙基乙二胺（PSA）、150 mg C18、900 mg无水硫酸镁］。　　29种农药对照品均购自德国Dr. Ehrensotrofer，标准品用丙酮配制成1 000 μg/ml的储备液，于4 ℃冰箱中避光保存。四氯化碳、氯苯、氯仿、乙腈、丙酮、氯化钠、无水硫酸钠均为分析纯，试验用水为超纯水。
分别吸取29种农药1 000 μg/ml的储备液1.00 ml置于同一50 ml容量瓶中，配制成质量浓度为20.0 μg/ml的混合标准液。之后用不含有目标化合物的样品溶液稀释成质量浓度为1.0 μg/ml的混合标准液，并逐步配制成0.00、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 μg/ml的标准曲线系列溶液。
　片剂、硬胶囊剂保健食品提取：称取粉碎样品2.0 g（片剂去外层辅料、胶囊去壳），置于50 ml离心管中，加入5 ml水和10 ml含0.5%甲酸的乙腈溶液，涡旋混合2 min，在混匀仪上振摇15 min后，加入NaCl约2.5 g，继续振摇5 min，8 000 r/min离心5 min。转移上清液至d-SPE管。　　液体制剂保健食品提取：称取10.0 g样品溶液，置于50 ml离心管中，加入10 ml含0.5%甲酸的乙腈溶液，涡旋混合2 min，在混匀仪上振摇15 min后，加入NaCl约3.5 g，继续振摇5 min，8 000 r/min离心5 min。转移上清液至d-SPE管。　　d-SPE净化：取6.5 ml上清液加到商品化12 ml PSA/C18净化管中净化，涡旋振荡混合1 min，8 000 r/min离心5 min。取净化好上清液5 ml到10 ml螺口锥型离心管中，室温水浴通氮气吹至约余半滴大小，在通风橱内将余下的溶剂挥发至近干。　　DLLME法萃取：向含有浓缩样品的10 ml离心管中加入5 ml 28 ℃超纯水，涡旋振荡30 s后，用微量注射器在离心管底部迅速注入氯仿52 μl、丙酮88 μl，之后28 ℃恒温混匀2 min，形成均匀的乳浊液，于8 000 r/min离心5 min。用微量注射器将沉淀相转移至含150 μl锥形微量内插管的样品瓶中，供GC-MS分析检测。
　色谱：毛细管色谱柱TG-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）配置5 m脱活保护柱；高纯氦（99.999%），流速梯度1.2 ml/min保持30 min，之后3 ml/min保持7.2 min；进样模式：程序升温气化（PTV）进样口，不分流反吹进样，不分流时间2.0 min，吹扫流量5.0 ml/min；传输压力：210 kPa；进样口初始温度75 ℃，进样后以2.5 ℃/s快速升至300 ℃，保持3.0 min，进样净化阶段再以14.5 ℃/s快速升至330 ℃，保持20.0 min；色谱柱升温程序：90 ℃保持5 min，然后以25 ℃/min升至180 ℃，以5 ℃/min升至280 ℃，再以10 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。进样体积1 μl。　　质谱：传输线温度250 ℃，离子源温度300 ℃；电离方式：电子轰击电离源（EI）；电离能量70 eV；溶剂延迟6.5 min。保留时间和选择离子见表1。 　选择合适的萃取溶剂是影响DLLME法萃取效果的重要因素之一，萃取溶剂应与目标化合物满足极性“相似相容”原理，同时对样品中干扰物质的溶解度尽量低，减少基质效应。萃取溶剂还应选择不溶于水且密度大于水的溶剂，在离心后能沉积到下层，如一些氯代烃类。本试验采用经d-SPE净化的保健食品样品水溶液5 ml，添加混合标准样品至浓度为0.5 μg/ml，分别对50 μl不同萃取剂四氯化碳、氯苯、氯仿进行回收率考察；并用0.5 μg/ml的溶剂混合标准样品对基质效应进行了考察。结果表明，氯仿具有最好的萃取效果，回收率较高且稳定，色谱峰形好；四氯化碳的萃取效率最差；采用氯苯萃取时，磷胺极性较强农药回收率偏低。　　分散剂要求既溶于水又溶于萃取剂，能与水、萃取剂构成微小液滴的三相乳化体系。试验比较了乙腈与丙酮的分散效果，发现两者均可以与氯仿、水溶液形成均匀的乳化体系，丙酮做分散剂时氯仿萃取液中的基质效应较小。这可能是由于丙酮与氯仿极性更相近，转移了氯仿中的部分杂质。本试验最终选择丙酮作分散剂，将d-SPE与DLLME法有效结合，使DLLME法可以应用于基质复杂样品前处理中。
　　氯化钠常用来调节样品溶液的离子强度，从而影响待测物在水相中的溶解度。本试验考察了DLLME法萃取程序中氯化钠用量分别为0.3～1.5 g时对保健食品农药残留平均回收率的影响，试验结果表明，若增加氯化钠浓度，富集倍数和回收率均明显降低。显示出随着离子强度的增加，水与有机溶剂互溶减小，难以形成均匀微小液滴的三相乳浊体系，使得沉积相体积增加、萃取效率降低，因此本试验选择不加氯化钠。　　考察了恒温时混匀萃取平衡时间分别为1.0～5.0 min时对萃取效率的影响。结果表明，当混匀时间>1.5 min时，萃取效率达到稳定状态，最终选择混匀时间为2 min。　　在提取时加入酸化乙腈，可以增加目标化合物在乙腈中的稳定性，提高提取率。弱酸性环境也会增加一些带酸性基团（如羧基、酰胺基、醚基等）有机磷农药在乙腈中的溶解度。pH降低时，电离平衡向中性分子方向移动，而中性分子比离子化分子在有机相中的溶解性更好，更容易转移到萃取剂中，萃取率相对更高。为了选择合适的样品溶液pH值，本试验考察了加入不同酸度乙腈（分别含0%甲酸、0.5%甲酸、1%甲酸）时的萃取率。结果表明，使用含0.5%甲酸的乙腈提取保健食品样品时，获得的萃取率最高。
　　根据单因素试验结果，本试验采用Design-Expert 8.0.6软件对选择分散剂体积（A）、萃取剂体积（B）和萃取温度（C）等因素进行响应面（response surface）优化，以保健食品中农药的平均回收率为评价指标，建立高效的试验模型。按照中心组合设计（central composite design）原理，每因素设5水平，分别用代码值-α、-1、0、1、α表示，因素水平见表2。得到的拟合方程差异有统计学意义（r=0.91，P<0.05），因素A、B、C对综合评分（平均回收率）的影响见效应面图1。由此可知，在3个因素的互相作用下，分散剂丙酮对综合萃取效率的影响较大，回收率随着分散剂丙酮的用量增大而增大，但在达到88 μl之后，若继续提高参数，回收率反而下降。温度对萃取效率的影响基本呈二次函数关系，在27.0～29.0 ℃时达到最大。萃取剂体积主要影响化合物的富集倍数，体积越小萃取效率越高，但体积过小时，基质效应较高、重现性变差，且不适于分析仪器的自动进样。结合实际应用，最终确定萃取优化条件为温度28 ℃、分散剂丙酮体积88 μl、萃取剂氯仿体积52 μl。 　将1.2.1配制的农药标准曲线系列溶液在1.2.3仪器条件下进样，分别测定其峰面积，并以此作为纵坐标，农药标准液的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，29种农药在0.05～1.00 μg/ml内具有良好的线性关系，其相关系数均>0.999，样品添加浓度为0.5 μg/ml水平的29种农药总离子流色谱图见图2。
　在经分析不含上述29种农药的保健食品中，分别进行添加水平为10、50和100 μg/kg的加标回收试验，每个浓度均做6个平行样，29种农药的平均回收率为70.3%～107.5%，相对标准偏差(RSD)均<10%，符合农药残留检测的要求，具体数据见表3。
　　本方法各农药检出限（LOD）是采用检测器3倍基线噪声，结合所用农药标准溶液的浓度、定容体积、稀释倍数、称样量和响应值（峰高）各因素计算所得，范围为0.3～3.0 μg/kg，LOD与定量限（LOQ）见表3，均低于我国相关标准规定的蔬菜农药MRLs值的要求。
　15份保健食品按1.2.2样品前处理方法平行制备2份，按1.2.3仪器条件进行测定。结果显示，样品1奶蓟草胶囊中毒死蜱的检出量是88.6 μg/kg、样品6丹参胶囊中毒死蜱的检出量是97.2 μg/kg。图3为样品9五味子片中含马拉硫磷，其含量为61.3 μg/kg。

　　本试验建立了d-SPE-DLLME-GC-MS法测定中　　　草药保健食品有机磷农药残留，可实现29种农药残留检测。该法前处理过程简单，减少了基质效应的影响，提高了检测速度，方法的线性范围、准确度、精密度及检出限均满足相关标准的要求，适合农药检测任务量日益增加的实际需要。