副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是革兰染色阴性嗜盐细菌，隶属于弧菌科弧菌属，常存在于近海水、海产品及盐渍食品中。该菌在海水中可存活47 d，淡水中可存活12 d，致病最小剂量为10⁵ CFU^［1］，是我国沿海地区夏、秋季食物中毒和急性腹泻的主要病原菌。我国每年因副溶血性弧菌导致的食源性疾病为495.1万人^［2］。尤其近几年来，由于副溶血性弧菌引起的食源性疾病案例在我国呈明显上升趋势，已超过沙门菌，成为最严重的食源性病原菌，已被列为食品安全事件调查的必检项目^［3］。
        研究^［4］显示，副溶血性弧菌的主要致病作用是其可产生溶血毒素，包括耐热性溶血毒素（tdh）、耐热性溶血毒素相关的溶血毒素（trh）以及不耐热溶血毒素（tlh），其中tdh和trh是副溶血性弧菌的主要致病因子，但其感染人使其致病的机制有待于全面认识和确定。当前流行的副溶血性弧菌中毒菌株以O3∶K6、O4∶K68和部分O1血清型为主，其感染量为10⁶～10⁸ CFU/g^［5-6］。
根据上世纪80年代日本学者研究^［7］报道，几乎所有的临床分离株都可产生神奈川现象，与水产品分离株差异有统计学意义，分别为96.5%与1.1%，据此实验室常将神奈川现象作为致病性判断依据。本试验采用多重聚合酶链式反应（PCR）方法扩增tdh和trh基因，在初步探索不同来源副溶血弧菌溶血素相关基因（tdh、trh基因）分布特点的基础上，分析tdh和trh基因与传统的神奈川现象的相关性，从而为深入研究副溶血性弧菌的致病性提供基础数据。
        240株O3血清型副溶血性弧菌菌株购自浙江省疾病预防控制中心微生物所菌种库。其中183株为O3∶K6血清型菌；57株为O3非K6群血清型菌。所有菌株的送样范围为浙江省境内（见表1）。其中46株分离自医院食物中毒患者的肛拭标本；42株分离自农贸市场的生鲜海产品（牡蛎、泥螺等）；152株分离自食源性中毒案例中的冷冻海产品（牡蛎、泥螺、对虾等）。tdh基因的阳性对照菌株（ATCC 33847）、trh基因的阳性对照菌株（ATCC 17802）由中国疾病预防控制中心惠赠。
        凝胶成像仪（意大利BIO-RAD Laboratories）、高压灭菌锅、离心机、恒温金属浴、生物安全柜（Forma Class Ⅱ，A2型，美国Thermo）。
营养肉汤、半固体琼脂和营养琼脂均购自杭州天和微生物试剂有限公司，我妻氏培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司），胰蛋白胨大豆琼脂（TSA，北京陆桥技术有限责任公司），PCR扩增体系和DNA Ladder Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa），副溶血性弧菌诊断血清（日本生研株式会社）。   
        将吸附副溶血性弧菌的磁珠拨入5 ml已灭菌的营养肉汤试管中，36 ℃培养6～8 h。振荡试管数秒，混匀，接种环取菌液在含3%NaCl的营养琼脂平板上进行分区划线，于36 ℃培养18～24 h。具体分离纯化过程参照GB 4789.7—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》^［8］方法。挑取不含杂菌的单个菌落，半固体琼脂穿刺保种备用。   
从半固体琼脂中取菌，四区划线到3%NaCl的TSA平板，于36 ℃培养18～24 h，获得单菌落。用接种环挑取单菌落于装有150 μl ddH₂O的EP管中，混匀，100 ℃恒温金属浴10 min，加热裂解，12 000 r/min离心5 min。取上清，作为DNA提取液。     
tdh和trh基因片段的引物均由TaKaRa公司合成，引物的设计参考文献［9］，引物序列见表2。PCR反应总体系为20 μl：含5 U/μl TaKaRa Taq 0.1 μl，tdh和trh基因引物各0.1 μl，模板DNA 2 μl，无Mg^2＋10×PCR Buffer 2 μl，25 mmol/L MgCl₂ 1.2 μl，2.5 mmol/L dNTP Mixture 1.6 μl，不足的部分由ddH₂O补足。PCR反应程序的参数为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环。循环结束后72 ℃延伸5 min，4 ℃下保存。
取5 μl PCR反应液，与1 μl 6×Loading Buffer混匀，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，100 ml凝胶体系加入3 μl 溴化乙锭。恒压100 V电泳25 min，用凝胶成像仪观察并保存结果。tdh基因扩增结果阳性的条带出现在400～500 bp之间，trh基因扩增结果阳性的条带出现在200～300 bp之间。    
        收取新鲜的兔血，用无菌生理盐水按1∶10的比例洗涤兔血3～5次。我妻氏培养基加热至干粉完全溶解后，沸水浴加热30 min，待温度下降至46～50 ℃时，与兔血以20∶1比例均匀混合，倾注平板。神奈川试验参照GB 4789.7—2013^［8］方法。其阳性结果为菌落周围呈现出半透明的β溶血环。     
将保存在半固体中的所有副溶血性弧菌从半固体四区划线传代至3%NaCl的TSA平板上，培养18～24 h，获得大量的培养物，制成菌悬液。血清学分型的试验参照GB 4789.7—2013^［8］方法。     
采用χ²检验方法验证多重PCR扩增tdh、trh毒力基因的方法和与神奈川现象之间是否具有相关性，作为检测方法可信性的依据。
本次试验共对240株O3血清型副溶血性弧菌进行了检测，其中O3∶K6血清型副溶血性弧菌共183株，O3非K6群血清型副溶血性弧菌共57株，该240株菌株的血清型均在试验准备阶段按1.2.6的方法再次进行过血清型鉴定，确认血清型结果无误。    
        用多重PCR方法对240株O3血清型副溶血性弧菌进行tdh和trh基因的扩增，183株O3∶K6血清型副溶血性弧菌中有182株检出tdh基因，检出率为99.45%（182/183），1株检出trh基因，检出率0.55%（1/183）。57株O3非K6群血清型副溶血性弧菌tdh基因检出率为3.51%（2/57），未检出trh基因。未发现tdh和trh基因均阳性的菌株。图1为240株O3血清型副溶血性弧菌中部分菌株PCR的电泳结果图。位于400～500 bp的条带为tdh基因的扩增条带，位于200～300 bp的条带为trh基因的扩增条带。tdh和trh基因扩增的具体试验结果见表3。
        183株O3∶K6血清型副溶血性弧菌中183株的菌落外面均出现β溶血环，发生溶血的概率为100.00%（183/183）；57株O3非K6群血清型副溶血性弧菌中，有6株的菌落外面出现了β溶血环，发生溶血的概率为10.53%（6/57）。240株O3血清型副溶血性弧菌，共计有189株的菌落外面出现了β溶血环，发生溶血的概率为78.75%（189/240）。试验结果见表3。  
        用统计学方法对这240株O3血清型副溶血性弧菌的数据进行分析处理：扩增出tdh基因的184株菌有182株菌在神奈川试验中呈阳性结果，2株菌呈阴性结果；未扩增出tdh基因的56株菌有7株菌在神奈川试验中呈阳性结果，49株菌呈阴性结果（见表4）。在240株O3血清型副溶血性弧菌中，1株菌株扩增出trh基因，其神奈川试验为阳性结果；未扩增出trh基因的239株，有188株菌在神奈川试验中呈阳性结果，有51株菌呈阴性结果（见表5）。以χ²检验方法比较tdh、trh毒力基因扩增的结果和神奈川现象是否具有相关性，结果显示：tdh毒力基因扩增的结果和神奈川现象有相关性（χ²=1.78，P>0.05），trh毒力基因扩增的结果和神奈川现象无相关性（χ²=186.01，P<0.05）。
        O3血清型副溶血性弧菌是目前引起感染性腹泻的主要病原菌^［10］。由于O3∶K6血清型的广泛性和重要性，本试验选取了以O3∶K6血清群为主的O3血清型副溶血性弧菌，检测其致病性。
神奈川试验是检测副溶血性弧菌致病性的最基本方法，能把绝大部分致病性副溶血性弧菌检测出来，但操作繁琐，所需时间长（大约需要4 d），而且存在部分tdh基因阴性菌株的漏检。与之相比，PCR的分子学方法快速、灵敏度高，可以省去增菌的步骤，但是选用哪一种引物进行PCR各国之间没有统一的标准，且有些基因片段的特异性不强，并不能将副溶血性弧菌与其他弧菌分辨开。
美国食品药品监督管理局^［11］推荐采用复合PCR检测tlh、tdh和trh基因，其基因引物序列引自BEJ等^［12］的文献；加拿大食品检验署^［13］推荐采用复合PCR法检测R72H DNA序列、tdh和trh基因，R72H基因是副溶血性弧菌的致病基因，具有副溶血性弧菌的高度保守序列，可以用于副溶血性弧菌种特异性检测，且能区分副溶血性弧菌和溶藻弧菌^［14］。
本试验借鉴了上述实验室所用PCR扩增毒力基因的方法，考虑到本试验所选用的副溶血性弧菌的血清型等多种因素，最后决定选用tdh和trh基因为模板进行PCR扩增。tdh和trh基因是副溶血性弧菌的毒力基因。环境分离株极少携带tdh或trh基因，因此，自然界中非致病性的副溶血性弧菌极为普遍；而临床分离株通常携带tdh或trh基因，或二者兼有^［15-16］。
利用复合PCR技术进行检测，尤其是选用tdh基因等种特异性基因与其他致病基因复合，不但可以将副溶血性弧菌检出，而且可从基因水平判断其致病性，并鉴定菌株的毒力强弱，大幅缩短检测判定周期，又比独立基因检测准确，具有很好的应用空间。其他国家正陆续将该方法引入标准。