温和噬菌体（也称溶原性噬菌体）可将其自身基因组整合于宿主菌基因组中，和其宿主菌之间建立起一种稳定的寄生关系，并随细菌基因组进行复制和传代，而不裂解宿主菌^［1］。整合于宿主菌基因组的温和噬菌体基因组被称为前噬菌体，带有前噬菌体基因组的细菌称为溶原性细菌。前噬菌体是细菌间基因水平转移的重要载体，其诱导的基因整合事件可帮助宿主菌获得对自身进化有用的DNA序列，例如使白喉棒状杆菌、大肠埃希菌和霍乱弧菌等细菌获得新的毒力基因和耐药基因，增强其致病性和耐药性，提高宿主菌对生存环境的适应能力^［2］。
肠球菌广泛存在于人体、动物、植物、土壤、水和食品中，目前细菌分类学上已将肠球菌划分为近50个种^［3］。作为乳酸菌，肠球菌常被用于食品发酵，改善食品风味和延长货架期。而且，肠球菌还是一种益生菌，可用于改善人畜免疫系统，维持肠道菌群平衡^［4］。然而，近几十年来发现，肠球菌也是社区和医院获得性感染的重要病原菌，常具有多重耐药性，可引起心内膜炎、菌血症、盆腔炎、新生儿感染、尿道炎等多种疾病^［5］。有报道^［1-2］显示，医院内高致病风险的粪肠球菌克隆群CC2携带有较多量的前噬菌体，其在促进菌株医院内适应性进化方面发挥了重要作用。属于CC2克隆群的粪肠球菌致病株V583基因组中的多个前噬菌体对宿主菌的致病性和耐药性有重要贡献，并且导致了人类心内膜炎感染。
希拉肠球菌是一种可引起人畜共患病的肠球菌。近年来，临床上由希拉肠球菌引起的急重症感染多有报道^［6-8］，但是对于希拉肠球菌的基因组信息还了解甚少^［9-11］，尤其是希拉肠球菌基因组中前噬菌体结构特征鲜有报道。前期工作中，已经从北京市市售生鲜猪肉中分离出1株达托霉素耐药希拉肠球菌R17，并对这株菌的全基因组开展了测序研究^［12-14］。本研究将分析希拉肠球菌R17基因组中前噬菌体的分布及其结构特征，探讨前噬菌体与其宿主菌的毒力基因和耐药基因之间的进化关系，以期对前噬菌体与其食源性宿主菌的相互影响有进一步认识。
希拉肠球菌R17分离自北京市市售生鲜猪肉，对达托霉素、红霉素、环丙沙星、四环素和杆菌肽具有耐药性^［13］。通过PacBio（Pacific Biosciences, Menlo Park, USA）平台对希拉肠球菌R17开展全基因组测序，其基因组含有一个环状的染色体和一个闭合的环形质粒pRZ1，GenBank登录号分别为CP015516和CP015517^［14］。
通过噬菌体查寻软件^［15］（PHAST，http://phast.wishartlab.com/）在线预测和注释希拉肠球菌R17基因组中的前噬菌体。使用美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站中的BLAST工具软件（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在GeneBank数据库中比对前噬菌体的同源序列。蛋白质直系同源簇数据库（COG，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）用于对同源蛋白功能进行分类。分别使用抗生素抗性基因数据库^［16］（CARD，https://card.mcmaster.ca/analyze)、毒力因子数据库^［17］（VFDB，http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)和环境杀菌剂和重金属抗性基因数据库^［18］（BacMet，http://bacmet.biomedicine.gu.se/)对前噬菌体中的抗生素耐药基因、毒力基因、环境杀菌剂和重金属抗性基因进行预测。其中，VFDB数据库BLAST分值在50分以上的基因被预测为毒力基因。      使用PHAST软件对希拉肠球菌R17基因组中染色体和质粒上的前噬菌体进行分析预测，结果显示R17染色体上有3个前噬菌体（图1A），其中Prophage-1和Prophage-2是不完整的噬菌体，Prophage-3是完整的前噬菌体。质粒pRZ1中有一个不完整的噬菌体Prophage-p（图1B）。Prophage-1和聚球藻噬菌体S-SKS1最为相似，Prophage-2和Prophage-3分别和肠球菌噬菌体Ef11和FL1A相似，质粒上的Prophage-p和葡萄球菌的SPβ-like噬菌体相似（见表1）。
希拉肠球菌R17基因组上4个前噬菌体的起始位点和终止位点信息如表1所示。在4个噬菌体中，Prophage-3最长，达到35.7 kb，染色体上的3个噬菌体总长为66.0 kb，占染色体全长（2 886.5 kb）的2.29%。质粒上的Prophage-p长达35.2 kb，占到质粒全长（73.6 kb）的47.83%。Prophage-1的 GC含量（38.57%）高于染色体GC含量（36.96%），Prophage-2和Prophage-3的GC含量低于染色体的GC含量，其中Prophage-2的GC含量最低，为33.68%，Prophage-p的GC含量（36.24%）高于质粒的GC含量（35.57%）。  使用BLAST软件比对发现，Prophage-1与希拉肠球菌（ATCC 9790）中相似序列的覆盖率达到100%，同源性高达98%；Prophage-2与希拉肠球菌（ATCC 9790）相似序列的覆盖率为69%，但匹配序列的最高同源性是99%；Prophage-3与屎肠球菌ISMMS_VRE_11相似序列的覆盖率为47%，匹配序列的最高同源性是90%；Prophage-p与屎肠球菌VRE001相似序列的覆盖率仅为39%，匹配序列的最高同源性是96%。
如图2和表2所示，Prophage-1中有13个蛋白编码区，其中8个是前噬菌体序列，5个是细菌序列。5个细菌蛋白中除一个是假设蛋白外，其余4个蛋白的COG功能分类都属于核苷酸转运和代谢功能相关蛋白。Prophage-2序列两端有噬菌体附着位点attL和attR，中间有11个蛋白编码区，其中一个编码区编码噬菌体毒力蛋白（见表3）。Prophage-3有完整的噬菌体编码序列，包含了49个编码区，编码了典型的噬菌体特征蛋白，如裂解酶、穿孔素、尾部蛋白、类尾丝蛋白、衣壳蛋白、头部蛋白、末端酶等蛋白（见表4）。Prophage-3序列中还有18个细菌编码蛋白，其中17个是假设蛋白，一个编码TIGR02 391家族蛋白。Prophage-2、Prophage-3和Prophage-p的编码蛋白在COG数据库中均没有功能分类注释。
在CARD抗生素抗性基因数据库、VFDB毒力基因数据库和BacMet环境杀菌剂和重金属抗性基因数据库中预测发现，定位于染色体上的Prophage-1、Prophage-2和Prophage-3中不含有抗生素抗性基因、毒力基因、环境杀菌剂抗性基因和重金属抗性基因。
Prophage-p中含有13个编码序列，5个噬菌体附着att序列（见图2和表5）。13个编码序列中编码前噬菌体基因8个，其中3个编码转座酶蛋白。编码细菌基因的CDS有5个，分别编码红霉素抗性基因、杆菌肽抗性基因和噬菌体流产感染蛋白。     噬菌体诱导的基因水平转移是细菌进化的主要驱动力之一，能使细菌快速获得生境适应性基因，在细菌多样性分化中起着重要作用^［19］。温和性噬菌体整合入细菌的过程中，宿主菌会保留能增  
        强其环境适应能力的基因，使其最终成为细菌基因组的一部分，同时选择性删除无用DNA，降低整合过程给宿主菌带来的基因复制负担。另外，整合入细菌基因组的前噬菌体间会发生同源重组或基因等位交换现象，加速细菌基因组的多样性分化^［20］。在希拉肠球菌R17基因组上发现的4个前噬菌体中，有3个前噬菌体可能发生了基因删除事件，从而造成了噬菌体序列缺失。
对多株细菌的基因组开展测序分析发现，前噬菌体是细菌短期内表现出种内或种间生物多样性的主要原因^［20］。临床分离致病株粪肠球菌V583基因组中含有7个完整的前噬菌体，序列总长超过染色体大小的25%^［1］。尽管Prophage-1、Prophage-2、Prophage-3仅占希拉肠球菌R17染色体总长的2.29%，Prophage-p仅占质粒全长的47.83%，但Prophage-2、Prophage-3和Prophage-p序列与肠球菌属种内和种间序列的覆盖度都较低，最低为39%。这不仅说明前噬菌体是造成肠球菌种内和种间基因分化的主要动力，也说明了希拉肠球菌R17前噬菌体中曾普遍发生过基因删除和重组事件。
        前噬菌体与细菌的致病力、耐药性以及环境抗性也有重要关系^［20］。细菌基因组中携带的前噬菌体往往是造成菌株之间致病性差异的主要原因。肠球菌是人体肠道常驻菌群的重要组成部分，但是致病株粪肠球菌V583基因组中就携带了前噬菌体编码的类血小板结合蛋白（platelet-binding-like protein），这种蛋白可黏附人类血小板，造成人类菌血症感染^［2］。近年来有研究^［2］发现，在很多粪肠球菌的临床分离株的基因组中都发现了多聚前噬菌体现象（polylysogeny），这说明前噬菌体在增加致病株的医院环境适应性方面发挥着重要作用。尽管在希拉肠球菌R17的前噬菌体中没有发现毒力基因，但应注意前噬菌体导致的菌株致病性变化。
        噬菌体是造成抗生素耐药性快速扩散的主要原因之一。近年来研究^［2］发现，氟喹诺酮类抗生素可以增强噬菌体的活性，导致细菌耐药性的加速传播。对奥地利市售50份鸡肉样品进行分析，发现有近一半样品遭到了噬菌体污染，而这种噬菌体可以有效地将抗生素耐药基因在细菌之间进行转移^［21］。本研究发现，市售生鲜猪肉中分离的希拉肠球菌R17的红霉素抗性、杆菌肽抗性都是由Prophage-p介导的，这说明前噬菌体在增加菌株多重耐药性方面发挥了关键作用。由于噬菌体对于食品工业常用消毒剂如酒精等，具有极强的耐受性，提示应密切关注噬菌体导致的耐药基因在食源性细菌中的扩散，合理采取消毒措施。
        噬菌体作为应对抗生素抗性蔓延的重要武器，也引起了广泛关注。由于噬菌体抗细菌感染的高特异性以及对人体的低毒性，可以减少抗生素的使用，一些前苏联国家长期使用噬菌体疗法对抗细菌感染类疾病^［22］，因此，研究细菌和噬菌体的相互影响，不仅可以深入认识细菌尤其是致病菌的致病性、耐药性和环境适应性的分子机制，而且对于监控致病菌变异、开发新型无抗生素抗菌疗法具有重要意义。