稀土元素（REEs）包括15种镧系元素及钪和钇共17种元素，镧是稀土元素的一种，是自然界中含量较多的稀土元素，是最具代表性的轻稀土元素之一，化学性质活泼，几乎能与所有的元素发生反应。镧离子主要通过静电引力与配位体形成离子配位键络合物，镧元素的离子半径和化学性能与钙相近，可影响钙的转运和生理功能。镧可起非特异性磷酸酶作用，还可与生物体内多种组织成分，如氨基酸、蛋白质、糖、维生素、含氧酸、辅酶等相互作用，从而导致细胞内一系列生理、生化的变化。我国是世界上稀土资源最丰富的国家，镧尤其是硝酸镧在我国得到广泛应用，以致环境中稀土元素水平逐渐上升，土壤、饮用水中均可检出镧元素，部分食品中稀土元素含量较高，尤其是茶叶中稀土含量超过现行食品安全限量标准的比例较大，中国是茶叶的主要生产国、出口国、消费国，因而逐渐引起学术界专家学者的注意^［1-2］。已有报道^［3］称长期摄入镧元素可能会引起免疫毒性，但目前缺乏相关毒理学资料，且毒性机制、敏感靶点和生物标志物还不清楚。免疫系统是机体较为敏感的系统，免疫系统效应变化是毒理学安全性评价中较为敏感的指标，可从整体、细胞、分子上的不同水平评价免疫功能变化^［3］。本试验选用硝酸镧作为受试物，探讨大鼠孕期染毒硝酸镧对子代免疫的影响，并获得敏感的生物学标志物。
        试验采用健康成年SD大鼠（SPF级），雄鼠体质量300～350 g，雌鼠体质量220～260 g，年龄在8周左右，购自华阜康生物科技股份有限公司［合格证号：SCXK（京）-2014-0004］，并饲养于中国疾病预防控制中心职业卫生所实验动物所［许可证号：SYXK（京）-2014-0043］。试验期间大鼠摄食饲料购自北京科澳协力饲料有限公司［合格证号：SCXK（京）-2014-0010］，动物自由饮水和进食，动物房内保持安静、清洁、通风和自然光照状态，温度21～24 ℃，相对湿度40%～70%，动物照度15～20 Lx，换气次数≥15次/h，12 h昼夜交替，空气清洁度7级，噪声db（A）≤60。每天观察动物的一般状况，包括活动能力、精神状态、行为表现、被毛和粪便情况等。
        流式细胞仪（美国BD FACS Calibur）、酶标仪（Denley Dragon，美国Thermo）、二氧化碳培养箱、超净工作台、磁力搅拌器、电子秤、恒温水浴锅。氧化镧粉末（用稀硝酸溶液配制，纯度为99.99%，北京有色金属研究总院），绵羊红细胞、冻干豚鼠血清均购自北京博尔西科技有限公司，水杨酸（SA）缓冲液（行知生物科技有限公司），Hanks液、RPMI1640培养液、青链霉素、胎牛血清均购自美国HyClone，磷酸盐（PBS）缓冲液、氨基酸溶液、谷氨酰胺均购自美国Gibco，刀豆蛋白（ConA）、脂多糖（LPS）均购自美国Sigma，T/B/NK流式检测抗体、CD4/CD8/CD3流式检测抗体、CBA Flex检测试剂盒、染色液均购自美国BD，琼脂糖、MTS细胞检测试剂盒均购自美国Promega。硝酸镧：氧化镧粉末加热溶解于稀硝酸溶液（1∶1稀释），完全溶解为无色透明溶液后制成硝酸镧储备液。使用前用去离子水稀释硝酸镧储备液，稀释过程中不断加热（＜60 ℃）并滴加少量饱和氢氧化钠溶液调节pH至6.0。ConA液：用1×PBS配制200 μg/ml的ConA液，临用时用0.2 μm的微孔滤膜过滤除菌，并将ConA液稀释至50 μg/ml。(LPS液配制同上。)完全培养基（200 ml）：RPMI1640培养液加20 ml 10%胎牛血清，加2 ml 1%谷氨酰胺（200 mmol/L），加1 ml青霉素（100 U/ml），加1 ml链霉素（100 μg/L），加1 ml氨基酸（100×），4 ℃保存。
        SPF级SD大鼠按雌雄2∶1的比例交配，发现阴栓视为孕鼠，将40只孕鼠随机分为4组，即对照组以及硝酸镧低、中、高剂量组，每组10只。于孕鼠妊娠的第7天至第16天灌胃硝酸镧水溶液，每日一次，硝酸镧的剂量分别为2、20、60 mg/kg BW，对照组灌胃等量蒸馏水，按体质量每隔3 d调整一次灌胃量。子代大鼠出生后第4天（PND4）进行窝标准化，随机剔除多余子代大鼠，使得每窝子代大鼠数目均为4只，雌雄各半，每组10窝。断乳后处死母鼠，子代大鼠按组分笼饲养，每窝选取雌雄各1只作为A队列共80只，另每窝选取雌雄各1只作为B队列共80只。
        选取A队列80只子代大鼠，其中包括40只雌鼠40只雄鼠，记录子代大鼠出生后周体质量，在PND52称终体质量、真空采血管采血2支［1支为乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，另外1支为普通非抗凝管，分别用于测全血淋巴细胞分型和血清细胞因子］，迅速摘取肝、肾、肺、脑、脾、胸腺称重后保存备用。
        选取B队列80只子代大鼠，其中包括40只雌鼠40只雄鼠，进行TDAR和淋巴细胞增殖试验。脱纤维绵羊血用PBS洗涤3次，2 000 r/min离心10 min，配制成2%绵羊红细胞溶液，每只子代大鼠腹腔注射0.6 ml。5 d后大鼠麻醉处死，取脾脏称重，放在盛有Hanks液的平皿内，清洗后磨碎分离脾T淋巴细胞，将细胞悬浮于1 ml Hanks液，1 000 r/min离心10 min，Hanks液洗2次，细胞离心后悬浮于1 ml RPMI1640培养液中计数，将细胞浓度调整为5×10⁶ 个/ml。0.8%琼脂糖溶液与pH=7.2～7.4等量、两倍浓度Hanks液混合，47 ℃水浴中分装，每份脾细胞悬液平行做两个，在小试管中逐一加入350 μl琼脂液、25 μl 10%的绵羊红细胞溶液、100 μl脾细胞、25 μl豚鼠补体，共500 μl液体迅速倾倒在30 mm小平皿内，37 ℃孵育3 h后用肉眼或者放大镜观察溶血空斑的数量^［4-6］。
        ConA诱导的脾T淋巴细胞增殖试验：将细胞浓度调整为1×10⁶ 个/ml。将细胞悬液分两孔加入96孔培养板中，每孔90 μl，一孔加10 μl 50 μg/ml ConA液，另一孔加10 μl完全培养基作对照，另设不加细胞的空白对照；置于5% CO2孵箱，37 ℃培养72 h，培养结束前4 h，每孔加20 μl四唑盐（MTS），继续培养4 h，培养结束后，酶标仪490 nm处测定吸光度值。LPS诱导的脾B淋巴细胞增殖试验：按照1.1.2所述方法配制50 μg/ml的LPS液，配制完全培养基。获得1×10⁶ 个/ml的脾细胞悬液，加入到96孔培养板中，每孔90 μl，制作两份平行样品，其中一孔加10 μl 50 μg/ml LPS液，另一孔加10 μl完全培养基做对照，另设不加细胞的空白对照；将培养板置于5% CO2孵箱，37 ℃培养68 h，每孔加20 μl MTS，继续培养4 h，培养结束后，酶标仪490 nm处测定吸光度值^［7］。
        将淋巴细胞重悬于染色液中，每管加入1 ml 预冷的染色液，4 ℃ 1 247 r/min离心 5min，重复2次，用预冷的染色液调整细胞终浓度为2×10⁷ 个/ml，将100 μl细胞悬液（10⁶ 个细胞）转移至流式管中，每管加入适量特异性表面抗体，冰上避光孵育20 min。用适量的染色液清洗细胞2次，每次1 ml/管，1 247 r/min离心5 min，倒掉上清，轻拍试管混匀细胞。每个试管加0.5 ml染色液重悬细胞后上流式细胞仪检测。
        用4 ml稀释液稀释细胞因子标准品，室温放置15 min，取9支流式管作为标准管，每管加入500 μl稀释液，梯度稀释为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256，最后一只加入500 μl稀释液作为阴性对照。按照每个指标每份样品1 μl微球的量，50倍稀释混合Rat Soluble Protein Flex Set捕捉微球待用。样品管中每管加入50 μl待测样品，轻轻混匀捕捉混合微球，吸取50 μl加入样品管中，室温孵育1 h。所有试验管中加入藻红蛋白（PE）检测试剂50 μl，轻轻振荡混匀。室温孵育2 h。加入1 ml wash buffer清洗液1 018 r/min离心5 min，去上清。加入300 μl wash buffer清洗，振荡重悬微球。上机检测γ-干扰素（γ-IFN）、白细胞介素-2（IL-2）、IL-4、IL-1α、IL-10、肿瘤坏死因子（TNF）含量。用FCAP Array 3.0进行标准曲线绘制及数据分析^［8］。
        试验结果以均值±标准差（±s）表示，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，方差齐时组间均数比较采用LSD法，方差不齐时组间均数比较采用Dunnetts T3法，设定检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
        使用基准剂量软件BMDS 2.6.0.1（美国环境保护署）分析大鼠各指标的剂量-反应关系。根据数据选择指数模型、希尔模型、线性模型和幂模型。基准效应（BMR）选择5%或10%，拟合优度检验P＞0.1时接受该模型，当多个模型通过拟合优度检验时根据赤池信息量准则（AIC）选择AIC最小的模型，并获得基准剂量下限（BMDL）。
        表1可见，各剂量组雄性子代大鼠体质量增重高于雌性子代大鼠，PND28高剂量组（60 mg/kg BW）子代大鼠体质量低于对照组（0 mg/kg BW），差异有统计学意义（P<0.05）。
        表2可见，硝酸镧3个剂量组子代大鼠肝脏、肺脏、肾脏、脑的绝对和相对重量与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

        如表3所示，高剂量组（60 mg/kg BW）雄性子代大鼠脾T淋巴细胞增殖能力均高于对照组（0 mg/kg BW），差异有统计学意义（P<0.05），存在剂量-反应关系。3个剂量组雌性子代大鼠空斑形成细胞个数（PFC）低于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。3个剂量组脾B淋巴细胞增殖能力雌雄均高于对照组（0 mg/kg BW），但差异无统计学意义（P>0.05）。         如表4所示，雌性子代大鼠NK细胞各剂量组均高于对照组，且随着剂量增大，NK细胞百分比增加，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。硝酸镧不同剂量组雌、雄子代大鼠CD4/CD8比值、T淋巴细胞数和B淋巴细胞数与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。雄性、雌性子代大鼠淋巴细胞分型结果见图1和2。
如表5所示，硝酸镧3个剂量组雌、雄子代大鼠血清γ-IFN、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF水平与对照组比较均差异无统计学意义（P>0.05）。
        根据本试验数据，选取脾T淋巴细胞增殖能力和NK细胞数两个指标进行BMD分析。表6显示拟合优度检验结果，根据赤池信息量准则（AIC）选择AIC最小、P值最大的模型，脾T淋巴细胞增殖能力最适用模型为幂模型，BMD值为43.38 mg/kg BW，BMDL为21.40 mg/kg BW，剂量-反应曲线如图3；NK细胞适用模型为希尔模型，BMD值为2.73 mg/kg BW，BMDL为0.21 mg/kg BW，剂量-反应

曲线如图4；因此，0.21 mg/kg BW可作为硝酸镧最敏感的免疫毒性参考值。

        发育免疫毒理学已逐渐发展成为免疫毒理学的新领域，胚胎早期暴露免疫毒性物质可以对免疫系统的发育产生短期或长期的影响^［9-10］。有研究^［11-13］表明，镧可能具有一定免疫毒性，表现为低剂量促进、高剂量抑制的现象，但目前对镧的免疫毒理学效应报道各异。试验结果可见体液免疫未出现有生理学意义的变化，细胞免疫指标中雄性子代大鼠ConA诱导脾T淋巴细胞增殖能力随剂量增加而增强，存在剂量-反应关系。可见硝酸镧对子代大鼠 免疫系统产生作用时，细胞免疫较体液免疫更早出现反应，更加敏感，较早出现可检测的改变。高剂量组 雄性子代大鼠脾T淋巴细胞增殖能力高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），但同样的改 变在雌性子代大鼠上并未发生，可见硝酸镧对雌雄子代大鼠脾T淋巴细胞增殖能力的影响雌雄表现不同，或者可以认为不同性 别子代大鼠不同性别脾T淋巴细胞增殖能力对硝酸镧的敏感性有差异。机体正常免疫系统可以维持淋巴细胞亚群的稳定，使之形成一定的比例范围。硝酸镧3个不同剂量组雌性子代大鼠外周血NK细胞均高于对照组，且随着剂量增大，NK细胞数量增加。可见染毒硝酸镧影响淋巴细胞亚群的百分比，使NK细胞数量增加。综上可知，本试验条件下母鼠孕期染毒硝酸镧对子代大鼠的NK细胞、脾T淋巴细胞产生轻微刺激作用，但未发现硝酸镧对子代大鼠产生免疫毒性作用。