产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens），革兰阳性直杆菌，在空气、土壤、水、人和动物的肠道中都可以发现此菌^［1］。产气荚膜梭菌可于20～50 ℃范围内生长，最适生长温度为45 ℃^［2］。由产气荚膜梭菌导致的食物中毒多与肉制品相关^［3］。产气荚膜梭菌是美国食物中毒最常见的致病菌之一，调查结果^［4］显示美国1998—2010年由产气荚膜梭菌引起的食物中毒事件中，肉类食品占食品源的92%，其中牛肉制品占46%，禽肉制品占30%，猪肉制品占16%。我国学者近年来也对食品中产气荚膜梭菌污染情况进行调查，冉陆等^［5］对140份市售食品样品进行产气荚膜梭菌污染情况调查，其中有32份样品为阳性，在阳性样品中，肉、禽类及其制品占93.75%，夏季肉类食品的阳性率高于冬季，一些熟肉食品产气荚膜梭菌的污染量甚至超过5.0log₁₀ CFU/g。当食入产气荚膜梭菌含菌量5.0log₁₀ CFU/g以上的污染食品时，即可引起食物中毒^［6］。王艳红等^［7］对231份肉类熟食进行产气荚膜梭菌检测，总检出率为38.96%，不同样品的检出率范围为13.33%～53.33%，其中猪肉制品最高，鱼类制品最低。王捷^［8］从变质罐头中检测出有产气荚膜梭菌，李爱军^［9］分析了一起产气荚膜梭菌引起的食物中毒，其含菌量达到6.72log₁₀ CFU/g。基于国内外的研究现状，产气荚膜梭菌仍然是引起食物中毒的重要食源性致病菌，河南省作为我国肉制品生产和加工的主要省份之一，急需对熟肉制品中产气荚膜梭菌的污染状况进行评估，以确保熟肉制品的质量安全。为了解河南省郑州市熟肉制品中产气荚膜梭菌的污染状况，本研究对11种259份样品进行检测，并使用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统和PCR分子生物学方法进一步鉴定，为预防产气荚膜梭菌食物中毒提供有益的参考。         2016年5～6月自河南省郑州市的5个超市中采集11种共259份样品，其中盐焗鸡21份、盐焗鸭11份、麻辣鸡上腿20份、卤猪脸33份、烧鸡71份、烤鸡18份、卤鸡腿32份、卤琵琶腿22份、可乐鸡腿11份、卤半片鸭10份和卤鸡肝10份，所有样品均为超市当天生产、在4 ℃下储存的散装熟肉制品。
        产气荚膜梭菌标准阳性菌株（ATCC 13124），购自美国模式培养物保藏所。
        3730XL型测序仪、2720 thermal cycler型PCR仪均购自美国Applied Biosystems，VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定系统（法国梅里埃），FR980型凝胶成像仪（上海复日科技仪器有限公司），DYY-5型稳压电泳仪（北京六一仪器厂），蒸汽压力灭菌锅，ST/35型真空包装机，恒温水浴锅，生化培养箱，洁净工作台，厌氧培养罐，均质器，DNA电泳槽，电热恒温水槽，冷冻高速离心机，SP10-1000型Surf系列精密单道可调移液器。
        胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂、液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）、缓冲动力-硝酸盐培养基、乳糖-明胶培养基、含铁牛乳培养基均购自北京陆桥技术股份有限公司，胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA，北京奥博星生物技术有限责任公司），厌氧菌及棒状杆菌鉴定卡ANC TEST KIT（美国bioMerieux.Inc公司），Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒［生物工程（上海）股份有限公司］。
        将购买的11种散装熟食样品在无菌操作台中装袋，然后进行真空包装，贴好标签，置于46 ℃培养箱中48～72 h，直至有胀袋现象出现，进行检测。
        国标鉴定法：参考GB 4789.13—2012《食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》^［10］中的方法，从每个胀袋样品中取25 g样品放入含有225 ml 0.1%蛋白胨水的均质袋中，均质100 s制成1∶10稀释液，梯度稀释制备10^-2～10^-5的系列稀释液，吸取各稀释液1 ml加入无菌平皿内，每个稀释度做2个平行，每个胀袋样品做3个平行。每个平皿倾注15 ml TSC琼脂，充分混匀，凝固后再加10 ml TSC琼脂均匀覆盖平板表层，待琼脂凝固后，37 ℃条件下厌氧培养20～24 h。典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落，从单个平板上任选5个（小于5个全选）黑色菌落做确证试验，标准菌株(ATCC 13124)作阳性对照。
        VITEK鉴定法：选取2株经国标法鉴定为产气荚膜梭菌的菌株（标号为S413-1和S413-2，分别来自不同的样品）进一步验证，标准菌株(ATCC 13124)作对照。按照VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定系统规定的操作配成菌悬液，填充鉴定卡并上机检测。
        分子生物学鉴定法：将选取的可疑菌S413-1和S413-2按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒的操作步骤进行检测，细菌16S rDNA菌种鉴定，提取DNA，用特定引物27-F（AGTTTGATCMTGGCT CAG）和1492-R（GGTTACCTTGTTACGACTT）进行PCR扩增（约1 500 bp），PCR产物纯化测序，将得到的16S rDNA序列在核糖体数据库（http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp）上比对［在生物工程（上海）股份有限公司完成］。
        按照GB 4789.13—2012^［10］选取典型菌落数在20～200 CFU之间的平板，计算典型菌落数。计算公式为：
                                                                                                                        
         其中：T为样品中产气荚膜梭菌的菌落数，CFU/g；A为单个平板上典型菌落（黑色菌落）数，CFU；B为单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数，CFU；C为单个平板上用于确证试验的菌落数，CFU；n1为第一稀释度（低稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；n2为第二稀释度（高稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数； 0.1为稀释系数；d为稀释因子（第一稀释度）。
        采用Excel 分别计算每份样品中产气荚膜梭菌的菌落数。计算公式为：
                                                                                                                     
         其中，A为每份样品产气荚膜梭菌平均值的估计值，CFU/g；X 为每份样品产气荚膜梭菌菌落计数结果取对数值后的平均值，CFU/g；n为每份样品中产气荚膜梭菌菌落计数取平均值后的对数值，CFU/g；SD为标准差。
        各指标数据采用Origin 8.0软件分析作图。 
        可疑菌在TSC平板上有黑色较大圆形菌落生成，从单个平板上任选5个（小于5个全选）黑色菌落，分别接种到FTG培养基，37 ℃厌氧培养24 h，在FTG液体培养基中有絮状物和气泡产生，取生长旺盛的FTG培养液1 ml接种于含铁牛乳培养基，46 ℃水浴培养2 h后呈现“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑；用接种环取FTG培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，37 ℃厌氧培养24 h，菌株无动力，只沿穿刺线生长，滴加0.5 ml硝酸盐还原试剂甲和0.2 ml试剂乙立即出现红色，表明菌株能将硝酸盐还原为亚硝酸盐；用接种环取FTG培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，37 ℃厌氧培养24 h，培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸，且明胶液化，这与标准菌株（ATCC 13124）的试验现象一致。
        标准菌株（ATCC 13124）的VITEK鉴定率99.9%，菌株S413-1和S413-2的VITEK鉴定率分别为98%和96%，鉴定结果是产气荚膜梭菌。
        菌株S413-1和S413-2的分子生物学鉴定结果见图1。将得到的16S rDNA序列在核糖体数据库上比对，结果表明是产气荚膜梭菌。
        259份样品中有38份样品检出产气荚膜梭菌，总检出率为14.7%，其中盐焗鸡和可乐鸡腿样品的污染情况比较严重，检出率分别为33.3%和27.3%，见表1。
        检测的259份样品中，大部分样品菌落总数检测值较高，当食入产气荚膜梭菌含菌量达5.0log₁₀ CFU/g以上的污染食品时，即可引起食物中毒^［6］，烧鸡、烤鸡和卤鸡腿样品的菌落总数分别达到5.2log₁₀、5.5log₁₀和5.2log₁₀ CFU/g，有引起食物中毒的可能，其他样品的菌落总数均在4.0log₁₀～5.0log₁₀ CFU/g之间，见图2。
        本研究了解了河南省郑州市熟肉制品中产气荚膜梭菌的污染状况，为熟肉制品中产气荚膜梭菌的控制提供一定的依据。所检测的259份熟肉样品中，盐焗鸡和可乐鸡腿样品的污染情况较为严重，烤鸡样品的菌落总数检测值较高（5.5log₁₀ CFU/g），卤琵琶腿样品的菌落总数检测值较低（4.1log₁₀ CFU/g）。烧鸡、烤鸡和卤鸡腿含菌量均达到5.0log₁₀ CFU/g以上，有可能引起食物中毒，应当引起重视。多数调查结果^［4-5,7］表明，肉类及其制品是产气荚膜梭菌的高危食品，应加强食品生产及销售的卫生监督管理，预防和控制食源性疾病的暴发。我国石家庄市疾病预防控制中心证实的一起产气荚膜梭菌食物中毒是由熏肘花引起的^［6］，而产气荚膜梭菌引起的疾病主要是食品烹饪后处理不恰当导致的^［11］。NIETO-LOZANO等^［12］发现，真空包装的煮制火鸡样品在贮藏过程中，从4 ℃移至28 ℃的环境温度中贮藏12 h后，样品中产气荚膜梭菌的量从2.0log₁₀～2.5log₁₀ CFU/g增至6.0log₁₀ CFU/g；因此，熟食熟制后的储藏及快速冷却过程是控制产气荚膜梭菌增长的重要阶段，但熟制后的肉制品缺乏合适的冷却处理策略，不恰当的冷却处理可能激活产气荚膜梭菌芽胞，在食品贮存的过程中可能萌发成繁殖体。如果原料肉中存在产气荚膜梭菌的孢子，肉类行业所采用的传统热处理措施不能将其杀死，在后续的冷却过程中，特别是没有遵循适当的冷却速率或当产品未妥善冷藏时，热激活的孢子会生长和繁殖，形成潜在的公共健康风险；另外，一些门店在销售过程中并没有将熟肉制品放入冰柜中冷藏，失去了低温的保存环境，这些不规范的操作都会对产品卫生状况产生影响^［13］。
        目前，鲜有关于熟肉制品较为完善、具体的卫 生检验标准。构建熟肉制品中产气荚膜梭菌动态预测模型，基于动态预测模型计算出其相对生长量的概率，研究合适的冷却控制策略，对于保障消费者的健康和利益，改善我国的食品安全状况具有重要的意义。